Bepaling van de moleculaire structuren van HIV envelop glycoproteïnen met behulp van Cryo-electron tomography en geautomatiseerde Sub-tomogram Middeling

Meer dan 60 miljoen mensen zijn besmet met hiv, het virus dat aids veroorzaakt. hiv/aids is een wereldwijde gezondheidscrisis, en hoewel intensieve onderzoeksinspanningen de levens van geïnfecteerde personen drastisch hebben verlengd, blijft een echt vaccin ongrijpbaar. Een belangrijk focuspunt van hiv-vaccinonderzoek is het envelop-glycoproteïne, dat hiv gebruikt om doelcellen binnen te dringen.

In deze video demonstreren we hoe we structuren van dit belangrijke eiwit verkrijgen met behulp van een beeldvormingstechniek genaamd cryo-elektronentomografie. Uitgaande van gezuiverd HIV, tonen we de stappen bij de preparatie van bevroren monsters, de stappen bij het vastleggen van elektronnmicroscopische beelden van deze bevroren monsters en de stappen bij het omzetten van deze beelden in structurele modellen die nuttig kunnen zijn voor het ontwerp van hiv-aids-vaccins. Een uniek aspect van wat we in deze video presenteren, is dat het werk wordt gedemonstreerd door leden van haar laboratorium uit een breed scala aan leeftijden, van middelbare scholieren tot studenten op universiteits- en postdoctoraal niveau, tot en met postdoctorale onderzoekers en senior wetenschappers.

De bereiding van gevitrificeerde virusmonsters die geschikt zijn voor cryo-elektrontomografie wordt gerealiseerd door een waterige suspensie van virussen te verspreiden over kleine gaatjes in een koolstoffilm die wordt ondersteund door een kopergrid, om de virussen vervolgens snel te bevriezen. Het doel van deze stap is om een bevroren preparaat van intacte virussen te maken die zijn vastgelegd in een bijna natuurlijke toestand. Ter begin worden de grids in een glow-discharge-apparaat geplaatst.

Dit apparaat reinigt de roosters door ze bloot te stellen aan geïoniseerd gas. Nu de roosters gereed zijn voor gebruik, wordt een suspensie van virussen gemengd met kleine gouddeeltjes bereid. Deze deeltjes zijn essentieel voor de gegevensverzameling en -verwerking.

Vervolgens wordt een druppel virusсусpensie op het vers plasmagereinigde grid geplaatst. Het grid wordt daarna in een robot geladen, die het met filterpapier droogt om de druppel tot een dunne vloeistoflaag te reduceren. Het monster wordt vervolgens in vloeibaar ethaan geplongeerd, waardoor de virussen razendsnel worden bevroren met een snelheid van meer dan 100 000 kelvin per seconde.

Het vriesgekoelde raster wordt vervolgens overgebracht naar een bewaardoos voor transport naar de microscoop. Dit wordt herhaald totdat het gewenste aantal rasters is ingevroren. Nu de rasters met de virusmonsters gereed zijn, is de volgende stap om deze in de microscoop te laden.

Voor beeldvorming kan dit handmatig of met robotische ondersteuning worden gedaan. Wanneer de monsterroosters handmatig worden geladen, bevindt de gebruiker zich aan een speciaal station waar de monsters onder vloeibare stikstof kunnen worden gemanipuleerd; de monsters worden geplaatst in een draagbare, stikstofgekoelde kamer die wordt afgesloten, vacuüm getrokken en vervolgens aan de microscoop wordt bevestigd. Nieuwere microscopen zijn in staat tot meer geautomatiseerd laden van monsters.

In een Titan Cryos-microscoop worden bevroren monsters door de gebruiker aangeleverd en vervolgens robotisch geladen met de monsterroosters in de microscoop. Elk rooster kan door de gebruiker worden onderzocht voordat de beeldvorming begint. De microscoopinstellingen worden geconfigureerd voor elk gebied op het monsterrooster dat interessante kenmerken vertoont.

In dit geval zijn de kenmerken HIV-virussen. Telkens wanneer een nieuw gebied wordt gedefinieerd, slaat de computer van de microscoop de gebiedsspecifieke beeldparameters op. Wanneer de gebruiker alle posities van belang heeft gedefinieerd, keert de computer automatisch terug naar elke positie en verzamelt een dataset.

Elke dataset wordt verzameld door het monsterrooster te kantelen ten opzichte van de elektronenbundel, waarbij wordt gewaarborgd dat de bundel gefocust blijft op hetzelfde punt op het rooster. Bij gegevensverzameling in de elektronenmicroscopie was het traditioneel vereist dat gebruikers bij de microscoop zaten en fysiek met de apparatuur interacteerden. Deze manier van interactie met de microscoop wordt hier getoond tijdens een bezoek van president Obama aan een Intel-fabriek.

Recente vooruitstellingen in computerinterfaces voor microscopen stellen gebruikers nu in staat om de gegevensverzameling in realtime te monitoren en aan te passen vanaf een computer op afstand in het laboratorium of elders. Om de vormen van de envelop en de glycoproteïne-spikes te visualiseren, moeten de gegevens van honderden individuele beelden worden gemiddeld om het signaal te versterken. Dit is een rekenintensief proces, dat hier wordt uitgevoerd met behulp van een computercluster genaamd Bio Wolf.

Bij de NIH zijn krachtige methoden ontwikkeld om individuele volumes te extraheren en de informatie te middelen met behulp van algoritmen die kunnen werken bij hoge ruisgehaltes. Gezien de aard van dit type gegevens bieden de dichtheidskaarten, verkregen van zowel natieve virussen als virussen gecomplexeerd met biologisch belangrijke moleculen, een rijke database met informatie over de structurele biologie van HIV. De dichtheidskaarten worden op moleculair detail zichtbaar wanneer de gegevens worden gecombineerd met informatie uit röntgenkristallografie van de individuele subunits die de envelope-glycoproteïne-spike vormen.

De gegevens die uit deze tomografieën voortkomen kunnen zeer compact zijn en moeilijk te interpreteren zijn. 3D-software voor de entertainmentindustrie kan worden gebruikt om de 3D-modellen te visualiseren door kleuren, texturen en belichting toe te voegen, waardoor ze gemakkelijker te analyseren zijn. Veelgebruikte visualisatiesoftware omvat Mirror 3D Studio Max en Maya.

We hebben zojuist stap-voor-stap procedures gedemonstreerd voor het verkrijgen van moleculaire modellen van de structuur van het envelopglycoproteïne, uitgaande van gezuiverd HIV. Met deze methode hebben we ook structuren bepaald voor het envelopglycoproteïne in complex met diverse moleculen die aan het virus kunnen binden en dit kunnen neutraliseren.

Hier tonen we een voorbeeld van de structuur van het envelopglycoproteïne in complex met een antilichaam genaamd B12. Inzicht in waarom sommige moleculen het virus kunnen binden en benutten terwijl andere dat niet kunnen, is van groot belang voor rationeel vaccinontwerp. Het bepalen van de moleculaire structuren van envelopglycoproteïnen van HIV of van andere virussen, zoals influenza en Ebola, is essentieel voor het begrijpen van virale entry en benutting.

Zoals u heeft gezien, komt cryo-elektronentomografie nu op als een krachtig instrument om dit doel te bereiken.