Structuur van HIV-1 capside Assemblies van cryo-elektronenmicroscopie en iteratief Helical Real-ruimte Wederopbouw

Het algemene doel van deze procedure is het bieden van een methode om een driedimensionale structuur van geassembleerde heli-moleculen te verkrijgen met behulp van cryo-elektronenmicroscopie. Het protocol begint met de preparatie van cryo-EM-monsters middels een snelle verdunnings- en backside-blottingmethode om de zoutconcentratie tijdelijk te verlagen bij het bereiden van het bevroren gehydrateerde EM-rooster. Dit proces waarborgt de eiwitstabiliteit terwijl de achtergrondruis wordt verminderd en de signaal-ruisverhouding wordt verbeterd tijdens de daaropvolgende cryo-EM low-dose data-acquisitie.

De helix-indexering van de diffractiepatronen is voltooid. Vervolgens wordt de beeldbewerking uitgevoerd, gevolgd door een 3D-reconstructie in de reële ruimte, wat resulteert in de uiteindelijke dichtheidskaart van het HIV-1-capside of de ca-buis. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden, aangezien er verschillende kritieke punten zijn voor een optimale gegevensverzameling en -analyse.

Bijvoorbeeld, in het geval van HIV vormen capsid-tubulaire assemblages die alleen ontstaan in een molaire bronoplossing door de zoutconcentratie snel te verlagen zonder de structuur te beïnvloeden. Het is cruciaal om cryo-EM-beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen. Gegeven een afbeelding van een tube is het zeer moeilijk om te bepalen hoe een kritieke tube geïndexeerd moet worden en welke software gebruikt kan worden voor 3D-reconstructie.

Deze video biedt een gedetailleerde en eenvoudige aanpak voor het verkrijgen van een 3D-reconstructie van fysieke objecten en kan als referentie voor uw experiment dienen. Ik zal de procedure demonstreren samen met Dr. Puja. We zijn beiden postdocs van Dr. Laboratory. Om de HIV-1 capsiden-eiwitassemblages voor cryo-EM voor te bereiden, begint u met het glow-dischargen van de koolstofzijde van koperen grids van 200 mesh bij 25 milliamps gedurende 25 seconden.

Gebruik een vernevelaar om de luchtvochtigheid in de klimaatkamer, die bestaat uit een zelfgemaakte handmatige zwaartekrachtplunjer, op 80% te brengen. Koel ondertussen vloeibaar ethaan in een vitro-fles plunjerdoer met vloeibare stikstof en monteer de plunge-vriesdoer op de handmatige zwaartekrachtplunjer. Gebruik vervolgens een pincet om de klemmen op de rand van het rooster te sluiten.

Breng 2,5 µL van een vooraf samengestelde eiwitoplossing aan op de koolstofzijde van het raster. Plaats vervolgens de pincet op de zuiger, waarbij de koolstofzijde van het raster naar buiten is gericht. Voeg drie µL laag-zout verdunningsbuffer toe aan de achterzijde van het raster.

Dep de grid onmiddellijk aan dezelfde zijde droog met een stuk filterpapier. Houd het gehele achteroppervlak van de grid ongeveer zes seconden lang in nauw contact met het filterpapier. Dompel de grid direct na het verwijderen van het filterpapier onder in vloeibaar ethaan.

Verwijder tot slot de pincet uit de zuiger en plaats het raster snel in een rasterbewaarbox. Start de cryo-elektronenmicroscopie door het bevroren gehydrateerde raster in een FEI polar G two elektronenmicroscoop te laden. De microscoop werkt bij 200 kilovolt en is uitgerust met een gatin 4K bij 4K CCD-camera.

Voeg in de zoekmodus bij een lage dosis een vergroting van ongeveer 200 x toe. Screen het gehele raster op gebieden met geschikt ijs. Sla de posities van deze gebieden op in een stage-bestand.

Roep de opgeslagen posities op en scan deze gebieden verder. Voeg een vergroting van 3.900 x toe in de low dose search-modus. Selecteer de gebieden met een uniforme dunne ijslaag voor datacollectie, die worden gekenmerkt door de aanwezigheid van lange buisjes die boven een gat zweven.

Sla alle gebieden op in een bestand voor de tweede fase. Schakel over naar de belichtingsmodus. Stel een vergroting van 59.000 x in en plaats een objectiefdiafragma van 100 micrometer.

Stel vervolgens het stigmatisme van de objectieflens en de bundelintensiteit in voor een dosis van ongeveer 15 elektronen per angstroom kwadraat per belichting. Keer terug naar de zoekmodus voor een lage dosis en ga naar een opgeslagen positie. Identificeer en centreer een geschikte tube.

Schakel met de CCD-camera over naar de focusmodus, stel de focus in en stel een defocuswaarde in, gewoonlijk tussen 0,5 en 2,5 micrometers. Schakel vervolgens over naar de belichtingsmodus en stel een belichtingstijd van 0,3 tot 0,5 seconden in voor een dosis van 15 elektronen per angstrom squared. Verzamel de beelden op een plaatcamera, waarbij de films 10 seconden de tijd krijgen om te stabiliseren voordat er een belichting plaatsvindt.

Nadat de beelden zijn verzameld, gaat u naar de volgende opgeslagen positie en herhaalt u dit proces om meer beelden te verzamelen. Ontwikkel de films in onverdunde D 19 gedurende 12 minuten. Digitaliseer de beelden vervolgens met een Nikon Super cool scan 9.000 ED-scanner met een pixelgrootte van 6,35 micrometers.

Een helixvormig object kan worden geïndexeerd door twee parameters: de Bessel-orde N en het laaglijnnummer L in de Fourier-transformatie van het oppervlakterooster van een helixvormig object. Elke laaglijn wordt gekenmerkt door N en L en komt overeen met een set lijnen op het oppervlakterooster, zoals aangeduid door de H- en K-indices.

Om te beginnen met de helicale indexering, gebruikt u het programma Helix boxer van Iman om een relatief lange en rechte buis met een uniforme diameter uit te snijden en slaat u de afbeelding op in MRC-formaat. Meet vervolgens de straal van de buis met behulp van het programma boxer van Iman. Bepaal de HEL-herhalingsafstand met behulp van een programma op basis van kruiscorrelatie, zoals I-M-G-C-C-F in het MRC-pakket.

Bereken vervolgens de foyer. Transformeer met een nieuwe box-lengte die een veelvoud is van de herhalingsafstand. Kies daarna twee hoofdvlaklijnen die twee basisvectoren van het oppervlakrooster definiëren, één nul en nul één in eenheden van FFT-pixels.

Bepaal de nummers van de laaglijnen evenals de radii van de maximale amplitude voor de twee hoofdlaaglijnen in de Fourier-transformatie. Gegeven de nummers van de laaglijnen en de waarden van de Bessel-orden voor de twee hoofdlaaglijnen, kunnen de rotatie tussen subeenheden en de axiale stijging van de eenstervormige helix worden verkregen met behulp van de selectieregel zoals beschreven in de schriftelijke procedure. Deze twee reële getallen beschrijven de schroefsymmetrie van de buis.

De 3D-reconstructie begint met de segmentatie van deeltjes met behulp van het programma Iman.Boxer. Nadat een micrografie met helix-deeltjes is geopend, wordt een deeltje in overlappende segmenten gesneden in het controlepaneel van Boxer. Kies de helix-modus en stel de parameters voor het boxen in.

De grootte van het box moet groter zijn dan de diameter van het particle en de waarde voor OLA moet ongeveer 90% van de boxgrootte bedragen. Nadat dit is gebeurd, zal het klikken op een van de uiteinden van de particle box automatisch een reeks particle boxes langs de lengte van de helix genereren, waarbij de ingeboxte segmenten en hun coördinaten worden opgeslagen. De volgende stap is het uitvoeren van de initiële 3D-reconstructie met de iteratieve helix real space reconstructiemethode I-H-R-S-R voorafgaand aan de verwerking met I-H-R-S-R.

Inverseer het contrast van de cryo-EM-beelden en pas LOWPASS-filtering toe. Open vervolgens de grafische interface van het I-H-R-S-R-programma door generator in te typen. Voer in de grafische interface alle informatie voor de stack met boxed particles in, inclusief de naam en het pad van de stack, het aantal beelden in de stack en de waarden voor de symmetrieparameters.

Klik op de knop 'voltooien' om het reconstructiescript te maken. B 25 SP.I Gebruik een massieve of holle cilinder als initiële referentie en laat de procedure cyclisch doorlopen totdat er geen wijzigingen meer optreden in de gedefinieerde schroefsymmetrie, wat gewoonlijk na enkele cycli gebeurt. Een rechtsdraaiende helixsymmetrie zou een stabiel geconvergeerde reconstructie moeten opleveren.

De reconstructie die in de vorige cyclus is gegenereerd, zal worden gebruikt als initiële referentie voor verdere verfijning. Voer ten slotte een 3D-reconstructie uit met iteratieve verfijning, waarbij de 3D-densiteitskaart die door I-H-R-S-R is gegenereerd, als initiële referentie dient voor aanvullende verfijning tijdens het proces. De helicale symmetrie is vastgesteld op de rotatie tussen subeenheden en de axiale stijging, welke zijn bepaald via de I-H-R-S-R-procedure.

Bepaal vervolgens de defocus en het astigmatisme in de micrograaf met behulp van de programma's CTF find three en CTF tilt uit de spider-programmapakketten, genaamd FT en mu; vermenigvuldig de partikelsegmenten met de contrastoverdrachtfunctie (contrast transfer function), afgekort als CTF. Voer projectiematching uit door projecties van de referentievolumes te vergelijken met de CTF-gecorrigeerde beelden met behulp van multi-referentie-uitlijning. De variatie in de tilthoek buiten het vlak is beperkt tot plus of minus 10 graden en wordt bemonsterd in stappen van één graad; introduceer beperkingen zoals hoge correlatiecoëfficiënten voor hoeken in het vlak nabij nul of 180 graden en beperkte X-verschuivingen.

Houd voor de uitlijningsparameters van elk segment in de reconstructie alleen die segmenten aan die aan de beperkingen voldoen. Na elke iteratieve verfijningscyclus wordt er een 3D-reconstructie gegenereerd met behulp van back projection, gedeeld door een bepaalde waarde over de CTF squared, waarna de helikale symmetrie wordt toegepast om een symmetries volume te genereren. De iteratieve verfijning wordt beëindigd wanneer er geen verdere verbetering meer optreedt in de resolutie van de nieuwe 3D-reconstructie.

Een enkele assemblage van een HIV-1 capside, een buis van 92 e, werd uitgesneden en de Fourier-transformatie hiervan werd berekend voor helix-indexering van de twee radii; de laaglijnnummers en de radii van maximale amplitude voor de laaglijnen 10 en 01 werden bepaald. Eindwaarden van respectievelijk -12 en 11 werden vervolgens berekend voor 10 en 01 met een herhalingsafstand van 5195,48 angstroms. De schroefsymmetrie van de buis werd bepaald als delta Z = 6,81 angstroms en delta phi = 328,88 graden; delta Z en delta phi werden verfijnd tot 7,13 angstroms en 328,86 graden met behulp van I-H-R-S-R, waarna na 10 iteratieve cycli een initiële reconstructie werd gegenereerd.

De uiteindelijke reconstructie na iteratieve verfijning verbeterde de dichtheidskaart aanzienlijk ten opzichte van het initiële model dat met I-H-R-S-R was berekend. De dichtheidskaart van de assemblagebuizen van het capside wordt weergegeven als drie orthogonale doorsneden parallel aan de as van de buis en dicht bij het oppervlak, loodrecht op de as van de buis, en parallel aan en door de as van de buis. De getoonde structuur is het resultaat van surface rendering van de 3D-dichtheidskaart met een contour van 1,8 Sigma die 100% van het volume omsluit.

Na het bekijken van deze video zou u een zeer goed begrip moeten hebben van hoe u een 3D-structuur van een volledig geassembleerd molecuul verkrijgt met behulp van cryo-elektronenmicroscopie.