Beoordeling van immunologisch relevante Dynamic tertiaire structurele kenmerken van de HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence door Ab initio Folding

Het algemene doel van het volgende experiment is om de dynamische structurele voorkeuren van de V3 crown-peptidevolgorde van de R2-stam van HIV te evalueren via AR-vouwing, en om de resultaten te correleren met de bekende neutralisatiegevoeligheden van de R2-stam. Dit wordt bereikt door een geschikt fragment van de R2 V3-loop crown te selecteren om AR bonni te vouwen. Als tweede stap wordt de simulatie van de vouwing uitgevoerd, waarbij alle mogelijke conformaties van het R2-crown-fragment worden gezocht en de meest waarschijnlijke conformaties in een stack-bestand worden geregistreerd.

Vervolgens worden de geregistreerde conformaties geanalyseerd om de dynamische structurele voorkeur van de R2V3-kroon te bepalen, wat de neutralisatiegevoeligheid ervan zou kunnen verklaren. De resultaten tonen een voorkeur voor een rigide bèta-strand op posities 12 tot 14 van de V3-loop, gebaseerd op de secundaire structuur, voorkeur en energieverdeling van de verzameling gezochte conformaties. Hallo, ik ben Timothy Cardozo en ik spreek u toe vanuit mijn laboratorium in de afdeling Farmacologie van de New York University School of Medicine.

Vandaag laten we u een procedure zien voor de abio eiwitvouwing van een flexibele lus op een immunogeen HIV-1 viraal eiwit, bekend als GP120. De flexibele lus staat bekend als de V3-lus van dit oppervlakte-envelopglycoproteïne van het HIV-1 virus en de top hiervan staat bekend als de kroon van de V3-lus. Dit is de regio die we zullen vouwen.

Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om ons te helpen productieve routes naar succesvolle HIV-vaccinontwerpen te identificeren. Laten we beginnen. Om deze procedure te starten, selecteert u de V3-crown-sequentie die in silico gevouwen moet worden.

Eerdere studies van dit laboratorium wijzen uit dat posities 10 tot 22 van elke V3-loopsequentie de beste resultaten geven; voer de armenio-vouwexperimenten uit met de gebruiksvriendelijke vervolgkeuzemenu's in de grafische gebruikersinterface of GUI van de ICM Pro moleculaire modelleringssoftware. Eerst moet de driedimensionale atomaire structuur van het peptide dat overeenkomt met deze sequentie in de virtuele ruimte van de computer worden opgebouwd. Ga om de driedimensionale atomaire structuur op te bouwen naar het bestandmenu en selecteer nieuw.

Hierdoor wordt een scherm met verschillende tabbladen geopend. Selecteer het tabblad peptide en plak of typ de sequentie in het tekstvak. Klik op oké om de driedimensionale structuur van het peptide op te bouwen.

De structuur zal verschijnen in het grafische venster van ICM. Zodra de driedimensionale structuur is opgebouwd, gaat u naar het menu moleculaire mechanica en selecteert u 'minimize', dat als een zijmenu zal verschijnen. Kies in het zijmenu voor 'global'.

Dit opent een scherm met verschillende invoervelden en selectievakjes die al zijn ingesteld op de standaardparameters. Pas indien nodig de selectie aan om het te vouwen peptide te kiezen. Pas de lengte en precisie van de simulatie aan door respectievelijk het aantal globale verplaatsingen en het aantal lokale minima-aanroepingen te wijzigen.

Selecteer 'all' voor de vouwing van alle atomen van het peptide. Selecteer vervolgens 'save movie' om een movie-bestand van de vouwing te maken. Klik ten slotte op 'apply' om de vouwing in het grafische venster te starten.

Het algoritme begint het peptide in verschillende conformaties te vouwen, waarbij de peptide-energie voor elke conformatie wordt berekend en vastgelegd. Na voltooiing worden de energetisch meest stabiele conformatie van het peptide, evenals alternatieve conformaties met nagenoeg dezelfde energie, geïdentificeerd en gevisualiseerd op de computer bij het uitvoeren van de peptidevouwing. Het gebruik van de GUI demonstreert hoe de vouwing eruitziet, maar staat geen ideale parameterselectie toe voor de vouwing van de V3-loop crown.

Hiervoor is het raadzaam om de vouwing uit te voeren vanaf de niet-grafische opdrachtregel met behulp van een script. Een script is simpelweg een reeks tekstcommando's die regel voor regel in een document of tekstbestand zijn opgeslagen, welke automatisch in het ICM-programma worden ingevoerd en na elkaar worden uitgevoerd om de V3-loop te vouwen. Schrijf eerst een tekstbestand dat op de harde schijf van de computer in een lokale directory wordt opgeslagen. Begin, zoals eerder gedaan, met het bouwen van het peptide in de virtuele ruimte van de computer.

Geef vervolgens een naam aan de simulatie en stel het aantal vrije variabelen in; dit zijn de chemische bindingen in het peptide die vrij gelaten worden om te roteren tijdens de vouwing. Specificeer daarna hoe lang de simulatie moet lopen voor een optimale vouwing van de V3-loop. Dit is afhankelijk van het aantal vrije variabelen dat in de vorige stap is vastgesteld om de precisie van de conformationele zoekactie in het experiment te bepalen; stel het aantal zoekstappen in dat moet worden uitgevoerd in elk lokaal minimum.

Stel vervolgens andere parameters in die op basis van eerder onderzoek zijn geoptimaliseerd voor de simulatie, waaronder de temperatuurminimalisatie, gradiënt en kansverdeling. Geef na het instellen van de experimentele parameters aan welke energieberekeningen tijdens de vouwing worden gebruikt. Hier wordt de energie van Vander Vi aangegeven als VW intern peptide.

Energie wordt aangeduid met 14, waterstofbindingsenergie wordt aangeduid met HB, elektrostatische energie wordt aangeduid met El Salvation. Solvatatie-energie wordt aangeduid met SF en entropie wordt aangeduid met EN. Specificeer de uiteindelijke instellingen, inclusief de voorkeurshoeken voor de backbone en zijketens die doorzocht moeten worden en de startconformatie.

Schrijf tot slot het commando om de berekening uit te voeren en op te slaan. Zodra het script is geschreven en als tekstbestand is opgeslagen, kan het worden uitgevoerd via de opdrachtprompt van het besturingssysteem van de computer. Zoals voorheen zal de energetisch meest stabiele conformatie van het peptide, evenals alternatieve conformaties met een vergelijkbare energie, worden geïdentificeerd en opgeslagen in het projectbestand voor visualisatie op de computer.

Zodra de berekening is voltooid, opent u het bestand door 'file open' te selecteren in het uitklapmenu van EE. Toon het molecuul door het selectievakje ernaast in het workspace-paneel aan te vinken en selecteer molecular mechanics stack view. Om de op basis van energie gerangschikte stack van de beste peptideconformaties uit de vouwing te bekijken, klikt u op het plotting-instrument in de rechterbenedenhoek van het stack-paneel om de resultaten te plotten.

Klik eerst op oké in het resulterende venster en klik vervolgens op het middelste tabblad van de grafiek genaamd best confo. Klik daarna op de eerste rij van de resultatentabel, wat de gevonden conformatie met de laagste energie in de zoekopdracht is. De peptide-structuur zal in het grafische venster worden herschikt naar de conformatie met de laagste energie.

Analyseer deze conformatie op kenmerken van bèta-stranden of alfa-helices, in het bijzonder in de eerste vijf posities van het peptide. Selecteer dit gebied in de sequentie en klik op het stokjes-icoon linksboven op het scherm om alle atomen weer te geven. Vervolgens moeten de resultaten van de energie-stack worden geanalyseerd om de beste conformaties te plotten.

Als de conformatie met de laagste energie door een aanzienlijk gat wordt gescheiden van de andere conformaties, duidt dit op een neiging tot een rigide structuur. Om de resultaten te evalueren, opent u het projectflesje en kiest u voor de 'molecular mechanics stack view'; er verschijnt een tabel met de stack-conformaties. Visualiseer de stack-conformaties door op het icoon voor het plot-histogram te klikken.

Klik tot slot op 'molecular mechanics stack play' om een animatie van de stapel te maken en de conformationele voorkeuren te visualiseren die hier door de vouwing zijn onthuld. De resultaten voor de R twee-vouwing worden getoond. De conformatie is niet alfa-helicaal en is een random coil, zoals verwacht voor V drie-loop crowns, met name in het fragment bij residu 12 tot 14.

In de V3-loop is in de gehele stapeling een duidelijke conformationele voorkeur voor bèta-strengen zichtbaar en worden er zeer weinig alfa-helikale conformaties waargenomen. Een lokale bèta-strengconformatie wordt herkend aan de uitgestrekte lineaire vorm. Dit is de locatie van de ongebruikelijke isoleucine-proline-methionine-sequentie van de R2-stam, een zeldzame sequentie in HIV-stammen op deze positie, waarvan wordt verondersteld dat deze verantwoordelijk is voor de ongebruikelijke kenmerken van R2.

Bovendien is er een energiekloof van bijna drie eenheden zichtbaar tussen de conformatie met de laagste energie en de op één na laagste energieconformatie. De structuur fluctueert dus minder dan 1% van de tijd uit de conformatie met de laagste energie, wat suggereert dat de R2V3 crown en de lokale beta-strainconformatie op posities 12 tot 14 een stijvere structuur hebben in plaats van een volledig flexibele aard. We hebben u zojuist laten zien hoe u een V3 loop crown-sequentie kunt vouwen met behulp van het abio-algoritme dat is geïmplementeerd in ICM-software, en we hebben u laten zien hoe u de resultaten kunt analyseren met behulp van de R2-strain van het HIV-virus.

Als voorbeeld: bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de identiteit van het vouwpeptide dat overeenkomt met een fragment van de V3-loop zorgvuldig te kiezen, en is het tevens belangrijk om de resultaten met betrekking tot conformationele voorkeur en energie te interpreteren in overleg met een expert op het gebied van moleculaire modellering. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.