Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) test voor eiwit-eiwit interactie in Onion cellen met behulp van de Helios Gene Gun

Deze procedure test de in vivo proteïne-proteïne-interactie tussen twee Arabidopsis-transcriptieregulatoren, SEU (kort voor SEUS) en LUH (kort voor LUHolog). Door gebruik te maken van biomoleculaire fluorescentiecomplementatie wordt SEU gefuseerd aan het N-terminale fragment van een geel fluorescent eiwit, of YFP, en wordt LUH gefuseerd aan het C-terminale fragment van het YFP-DNA van de twee plasmideconstructen. SEU-NYFP en LUH-CYFP worden via bombardement in onion epidermale cellen gebracht om hun interactie te testen.

Een interactie tussen Seuss en LUH brengt de associatie van de N-terminale en C-terminale fragmenten van YFP in kernen teweeg, wat leidt tot YFP-fluorescentie in de kernen. Na incubatie gedurende 16 tot 20 uur in het donker worden de epidermale vliezen van de ui waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop om de fluorescentie te visualiseren. Hallo, ik ben Courtney Hollander van het laboratorium van Dr. Zhi Lu bij de afdeling Celbiologie en Moleculaire Genetica aan de Universiteit van Maryland.

Vandaag laten we u een procedure zien voor het testen van eiwit-eiwitinteracties in uicellen met behulp van het BioRad Helios gene gun. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium voor het testen van eiwit-eiwitinteracties en eiwitlokalisatie in plantencellen. Laten we beginnen.

Om met deze procedure te beginnen, bereidt u de cartridges voor het Helios genenkanon volgens het JoVE-protocol van Woods en Zeto 2008, waarin de procedure voor de bereiding van cartridges voor elke batch gedetailleerd wordt gedemonstreerd. Voor BIFC worden 50 micrograms totaal plasmage-DNA gemengd met 12,5 milligrams gouddeeltjes en 0,5 milligrams per milliliter PVP-oplossing. Met gebruik van dezelfde cartridgebereiding worden de twee plasma-DNA's van de vermeende interacterende eiwitten gecombineerd: Seuss gefuseerd aan de N-terminale helft van YFP, afgekort als seus-NYFP, en LU Homolog gefuseerd aan de C-terminale helft van YFP, afgekort als L-U-H-C-Y-F-P.

De gecombineerde hoeveelheid is 50 microgram per preparatie, wat resulteert in maximaal 50 cartridges met één microgram DNA per 0,25 milligram goud per cartridge. Elke cartridge is bedoeld voor één schot. Test na de bereiding van de cartridges of de goudpartikels efficiënt worden voortgestuwd.

Wikkel een vierkant stuk parafilm rond een Petrischaal. Stel vervolgens de heliumdruk in op tussen 150 en 200 PSI en schiet de nieuw gemaakte cartridges in het vierkant parafilm. Observeer zwakke gouddeeltjes op de parafilm.

Verschillende hoeveelheden gouddeeltjes kunnen bij verschillende heliumdrukken op het parfum worden geprojecteerd. Indien er echter geen significant verschil is, kies dan de lagere druk voor het bombardement. Deze test geeft daarnaast het gebied aan dat door elke shot-procedure wordt bestreken.

Om het uienweefsel voor te bereiden, verwijdert u de buitenste schil van een grote gele ui met een schoon en scherp scheermesje. Snijd een rechthoekig vlak van twee bij acht centimeter uit, vier tot vijf lagen diep. Haal het rechthoekige uienweefsel eruit en gooi de buitenste twee lagen weg.

Snijd de overgebleven lagen van de ui in stukjes van ongeveer 1,5 centimeter vierkant. Plaats de stukjes ui in een petrischaal waarin cirkelvormige stukjes filterpapier van drie mm bevinden. Bevochtig deze met steriel water en dek de petrischaal af.

De stukjes ui zijn klaar voor bombardement. Plaats eerst de cartridges in de witte ronde cartridgehouders; yerlaad cartridges met verschillende plasmidconstructen in verschillende cartridgehouders. Elke cartridgehouder kan maximaal 12 cartridges bevatten voor 12 schoten.

Hier worden drie verschillende houders geladen. De eerste houder bevat cartridges met 35 S-G-F-P-A, een sterke en constitutieve promoter van het bloemkoolmozaïekvirus. Dit plasmide dient als positieve controle.

De tweede houder wordt geladen met de experimentele cartridges die een gelijke hoeveelheid S-E-U-N-Y-F-P en L-U-H-C-Y-F-P bevatten. De derde cartridgehouder wordt geladen met cartridges die een equimolaire mix van de puck spine-vector en LUH puck spice bevatten. Dit dient tevens als negatieve controle.

Plaats de batterij en de nieuwe loopvoering in het Helios genenpistool. Controleer of zowel de loopvoering als het pistool zijn voorzien van de respectievelijke O-ringen. Plaats vervolgens een lege cassettehouder in het genenpistool, waarbij het markeringsnummer 12 op de cassettehouder naar de bovenkant van het pistool is gericht.

Schuif de patroonhouder één of twee keer naar voren om er zeker van te zijn dat deze correct is geplaatst. Sluit vervolgens het pistool aan op de heliumtank en stel de druk in op tussen 150 en 200 PSI. Draag gehoorbescherming en vuur het pistool enkele keren af door de zijknop ingedrukt te houden terwijl u de trekker overhaalt. Door het pistool af te vuren met de lege, geladen patroonhouder, wordt de kamer van het pistool gereinigd en wordt gewaarborgd dat de druk stabiel is.

Voordat het DNA wordt afgevuurd, kan het afvuren van een stukje ui dienen als negatieve controle voor achtergrondfluorescentie. Om de met DNA gecoate gouddeeltjes af te vuren, verwijdert u de lege patroonaanhouders en plaatst u de eerste geladen patroonaanhouder met de positieve controle. Schuif de patroonaanhouder zodanig naar voren dat de patroon die moet worden afgevuurd zich onderaan de patroonaanhouder bevindt.

Plaats nu de stukjes ui in het midden van een lege Petrischaal, waarbij de binnenste laag van de ui naar boven is gericht. Plaats de loopvoering van het genenkanon op de Petrischaal en vuur het kanon af. Ga over naar de volgende cartridge en schiet op een ander stukje ui.

Herhaal deze stap totdat vier tot vijf stukjes ui zijn beschoten. Elk stukje ui wordt slechts één keer beschoten. Verplaats het gebombardeerde stukje ui naar een Petrischaal met vochtig filterpapier van 3 mm om de experimentele patronen te laten ontkiemen.

Wissel naar cartridge Holden. Ten tweede, vergeet niet de loopvoering te vervangen om contaminatie te voorkomen. Schiet vier tot vijf stukjes ui, zoals zojuist getoond, voor de positieve controle.

Vervang vervolgens de cartridge door die van Holden. Nummer drie, die het negatieve controle-DNA bevat. En schiet opnieuw vier tot vijf stukjes ui.

Vervang de huls van de loop om contaminatie te voorkomen. Na het bombardement. Dek de Petrischalen met de stukjes ui af met de deksels.

Wikkel ze in parafilm om uitdroging te voorkomen. Incubeer de uienstukjes gedurende 16 tot 48 uur bij kamertemperatuur in het donker. Zodra het bombardement is voltooid, sluit u het gas af en laat u de druk ontsnappen voordat u de genenkanon loskoppelt van de heliumtank; draai de loopvoering los en verwijder de cartridgehouder en de gebruikte cartridges.

Reinig ten slotte de cartridgehouders en hulsvoeringen door ze onder te dompelen in een bekerglas met zeepsop en te soniceren gedurende 20 minuten. Spoel ze daarna af met water om alle zeepresten te verwijderen.

Week gedurende een uur in 70% ethanol en droog vervolgens af met papieren handdoeken. Observeer de uienstukjes 16 tot 20 uur na het bombardement. Nadat de gebombardeerde uienstukjes 16 tot 20 uur bij kamertemperatuur zijn geïncubeerd, wordt met een platte pincet voorzichtig een enkele cellaag van de binnenste epidermis van de ui gepeld.

Dit is de laag die tijdens het bombardement direct naar het pistool is gericht. Plaats de geschilde laag op een druppel water op een objectglas met een dekglas. Wees echter voorzichtig om luchtbellen te minimaliseren.

Observeer GFP- of YFP-fluorescentie met een fluorescentiemicroscoop, zoals de zes axio observer, point Z one die hier wordt getoond onder het helderveld van de microscoop. Controleer eerst op cytoplasmatische stroming om er zeker van te zijn dat de cellen in leven zijn. Om dit te doen.

Stel het preparaat een paar minuten bloot aan het lichtveld om het uienweefsel op te warmen en zoek vervolgens naar bewegende plastiden. Cytoplasmatische stroming is niet altijd gemakkelijk te zien, dus raak niet ontmoedigd als dit niet duidelijk zichtbaar is. Gebruik voor fluorescentiedetectie geschikte excitatie- en detectiefilters voor GFP of YFP. Controleer ook de negatieve controles, dit zijn de uienstukjes die zijn beschoten met een niet-fluorescerend plasmide.

Zwakke gele signalen kunnen verschijnen vanuit beschadigde cellen en debris en uien. Controleer daarnaast de positieve controles. Het plasmide dat een constitutief tot expressie gebrachte fluorescerende reporter bevat.

GFP-fluorescentie is zichtbaar in sommige, maar niet in alle cellen. Luchtbellen kunnen ook leiden tot achtergrondfluorescentie. Zichtbare GFP-signalen uit onion epidermal cells geven aan dat de cartridges, de uienweefsels en het afvuren van de gene gun correct zijn voorbereid en uitgevoerd.

Hier is de sterke fluorescentie te zien die werd waargenomen bij het 35 SGFP-positieve plasmide. De sterke fluorescentie is zichtbaar in de gehele cel, inclusief zowel de nucleus als het cytoplasma. De brightfield-afbeelding maakt het mogelijk om de overeenkomstige contouren van de cellen en nuclei te zien.

Niet elke cel is getransformeerd. Het YFP-fluorescentiesignaal wordt gedetecteerd in de celkern van de ui wanneer de experimentele combinatie Seuss, NYFP en L-U-H-C-Y-F-P in uicellen wordt gebombardeerd, wat aangeeft dat Seuss NYFP en L-U-H-C-Y-F-P in vivo interageren. Echter is deze door interactie gemedieerde fluorescentie significant zwakker dan de 35 SGFP-gemedieerde fluorescentie in de positieve controle.

Daarnaast zijn de transcriptiefactoren SEUS en LUH gelokaliseerd in de kernen. Hierdoor is de YFP-fluorescentie alleen in de nucleus waarneembaar. Bovendien is het aantal fluorescerende cellen significant lager dan dat van de 35 SGFP positieve controle.

Dit komt omdat B FFC alleen werkt wanneer beide partnerplasmiden tot expressie komen in dezelfde uicellen. Er wordt geen fluorescent signaal gedetecteerd in uien die zijn gebombardeerd met cartridgehouder nummer drie, die een mengsel van puck spine, vector en L-U-H-C-Y-F-P bevat, zoals verwacht is bij de negatieve controle. We hebben u zojuist laten zien hoe u uicellen kunt bombarderen om eiwit-eiwitinteracties te testen met behulp van het BioRad Helios gene gun-systeem.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat er geschikte positieve en negatieve controles moeten worden gebruikt en dat de BIFC-fluorescentie een zwakker signaal kan vertonen en dat het aantal fluorescerende cellen lager kan zijn. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.