Kwantificering en analyse van de vorming van HO-endonuclease chromosomale translocaties Gestimuleerd door Single-Strand Gloeien in Saccharomyces cerevisiae

Het algemene doel van deze procedure is om de genetische controle van translocatievorming door enkelstrengs annealing in diploïde buddinggistcellen te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst culturen te inoculeren met enkele kolonies van een specifiek genotype en deze gedurende de nacht te laten groeien. De tweede stap van de procedure is het induceren van gelijktijdige vorming van dubbelstrengs breuken door ho-endonuclease op twee chromosomen door de toevoeging van galactose aan de culturen.

Vervolgverdunningen van deze culturen worden geplaatst op selectieve en niet-selectieve media. De laatste stap is het bepalen van de translocatiefrequentie door de kolonies te tellen die ontstaan op selectieve en niet-selectieve media. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de genetische controle van translocatievorming door enkelstrengsbreuken aantonen via veranderingen in de frequentie van gestimuleerde translocatievorming in stammen met verschillende genotypen.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de gevolgen van therapeutische bestraling bij kankerpatiënten, aangezien DNA-dubbelstrengse breuken en de vorming van translocaties de primaire gevolgen van deze behandeling zijn. Om de procedure voor het bepalen van de ho-gestimuleerde translocatiefrequenties te starten, inoculeert u 10 tot 20 onafhankelijke culturen van één milliliter YPD-glycerol-lactaatmedium met enkelvoudige kolonies van het gewenste genotype en incubeert u de culturen overnight bij 30 °C op een rotator. Wanneer de culturen de gewenste celdichtheid hebben bereikt, voegt u 20% galactose toe aan de culturen tot een eindconcentratie van 2%. De galactose zal de expressie van de ho-endonucleasedirigeren, die dubbelstrengse breuken zal veroorzaken bij het history delta 5 prim-allel op chromosoom 3 en het has 3 delta 3 prim-allel op chromosoom 15; incubeer gedurende vier uur bij 30 °C op een rotator.

De volgende stap is cruciaal voor het succes van de procedure. Zorgvuldige verdunning en het uitplaten van de culturen is noodzakelijk. Om translocatiefrequenties te verkrijgen die voldoende reproduceerbaar zijn om statistisch significante vergelijkingen tussen stammen van verschillende genotypen mogelijk te maken, moeten na vier uur geschikte verdunningen van de culturen worden geplaat op medium zonder histidine, evenals op YPD. Om ongeveer 100 tot 200 kolonies per plaat te verkrijgen, moeten de platen twee tot drie dagen worden geïncubeerd bij 30 °C.

Wanneer er kolonies ontstaan, kan de translocatiefrequentie worden bepaald. De plateringsefficiënties voor en na inductie van de expressie van ho-endonuclease zullen aangeven of de aanwezigheid of afwezigheid van een van beide translocatiechromosomen de overlevingskans na de vorming van DSB beïnvloedt. Dat fragmenteert één kopie van zowel chromosoom drie als chromosoom 15 om de plateringsefficiënties vóór inductie te bepalen.

Verwijder eerst een aliquot cellen uit elke overnight-cultuur en bepaal het celgetal door te tellen met een hemocytometer. Gebruik vervolgens een passende verdunning om ongeveer 100 tot 200 cellen op YPD uit te platen en incubeer gedurende twee tot drie dagen bij 30 °C tot er kolonies ontstaan. Voeg 20% galactose toe aan de resterende culturen tot een eindconcentratie van 2% en incubeer bij 30 °C gedurende vier uur om de plating-efficiëntie na inductie te bepalen.

Neem na vier uur inductie een aliquot cellen uit elke cultuur en bepaal het aantal cellen met een hemocytometer. Plaats ongeveer 100 tot 200 cellen, met behulp van een geschikte verdunning, op YPD en incubeer gedurende twee tot drie dagen bij 30 °C totdat er kolonies ontstaan. Zodra er kolonies op de platen verschijnen, kan de plating-efficiëntie worden bepaald. Vermoedelijke klonen met translocaties kunnen worden onderzocht via southern blot.

Voor deze procedure wordt genomisch DNA gebruikt dat is geprepareerd uit een enkele hiss plus recombinante kolonie van elke onafhankelijke trial. Verteer ongeveer vier microgram van elk DNA-monster met het restrictie-endonuclease BAM H one. Scheid de met BAM H one verteerde fragmenten op een 0,7% agarosegel en breng deze vervolgens over naar een positief geladen nylonmembraan, dat wordt gehybridiseerd met een P 32-gelabelde probe verkregen door random priming met een 1,8 KILOBASE BMH one BMH one genomische kloon die het HIS drie-gen bevat. Visualiseer de DNA-fragmenten via autoradiografie of phospho-imaging. Een andere manier om putatieve translocatiedragende klonen te onderzoeken is via chromosoomplotanalyse.

Chromosomen worden eerst geprepareerd uit geselecteerde hiss plus recombinanten in aros plugs; afzonderlijke chromosomen worden gescheiden op een 1% aros gel in een contour clamped homogeneous electric field of chef bij 14 °C. De volgende parameters worden gebruikt: eerste blok 14 °C, 72 s schakeltijd en 15 uur bij 6 V/cm, tweede blok 14 °C, 122 s schakeltijd en 11 uur bij 6 V/cm. Na voltooiing van de elektroforese worden de chromosomen gevisualiseerd door de gel gedurende 30 minuten te kleuren met EtBr, gevolgd door bestraling met UV en ontkleuren in gedestilleerd water. De chromosomen worden vervolgens door capillaire werking overgebracht naar een positief geladen membraan.

Hybridiseer onder denaturerende omstandigheden met een P 32 gelabelde probe, verkregen door random priming met een 1,8 kilobase bam H one bam H one genomische kloon die het hiss. Three-gen bevat. Visualiseer de chromosomen via autoradiografie of fosfor-imaging. De frequentie van chromosomale translocaties kan worden berekend door het aantal histaminetrofische kolonies te delen door het totale aantal levensvatbare cellen, bepaald door uitplating op YPD.

In dit voorbeeld is de berekende recombinatiefrequentie ongeveer 3%. De assay voor ho-gestimuleerde translocatiefrequenties kan worden uitgevoerd met stammen van verschillende genotypes om verschillen in het vermogen om dubbelstrengs breuken via enkelstrengs annealing te herstellen te vergelijken, zoals getoond in deze representatieve grafiek. De translocatiefrequenties die zowel selectief als niet-selectief met de RAD 51 delta null homozygote werden verkregen, waren statistisch verschillend van die verkregen onder overeenkomstige omstandigheden met de wildtype-stam, zowel vóór als na inductie van het uitplaten.

Efficiënties worden bepaald door het totaal aantal levensvatbare kolonievormende cellen te delen door het totaal aantal cellichamen in de cultuur, bepaald via een tellingsmethode met een hemocytometer zoals weergegeven in deze tabel, vóór en na het uitplaten van de inductie. Efficiënties verschilden niet significant voor wild-type cellen, wat suggereert dat de aanwezigheid of afwezigheid van een van de translocatiechromosomen geen invloed heeft op het vermogen om DSB-vorming te overleven.

Vermoedelijke translocatie-bevattende klonen kunnen worden onderzocht via genomische Southern blot-analyse. Een grafische weergave van de relevante chromosomen vóór en na de vorming van de translocatie wordt hier getoond. De grootte van de restrictiefragmenten die de relevante sequenties bevatten, gegenereerd door BamH1-digestie van genomisch DNA van ouder- en recombinante stammen en zichtbaar gemaakt op blots door hybridisatie met een 1,8 kilobase BamH1-probe.

Zijn drie genomische klonen zijn weergegeven in kilobasenparen voor southern blot-analyse. Genomisch DNA wordt digested met BMH one endonuclease en gehybridiseerd met een P 32-gelabelde probe van 1,8 kilobasen van HIS drie om deze diagnostische fragmenten te visualiseren.

0,8 kilobase HIS3 Δ20, 1,7 kilobase HIS3 Δ3', 4 kilobase T3 15, 5 kilobase T15 3 en 8 kilobase HIS3 Δ5' fragmenten. Baan A is de ouderlijke diploïde. Baan B is een HIS+ niet-reciproce translocatierecombinant en baan C is een HIS+ reciproce translocatie.

Recombinante chromosomale BLO-analyse kan ook worden ingezet om klonen met translocaties te onderzoeken. Intacte chromosomen, geprepareerd in agarose-plugs, worden gescheiden via pulsed-field elektroforese en de gel wordt gekleurd met ethidiumbromide en gevisualiseerd onder UV-licht. De gescheiden chromosomen worden vervolgens overgezet op nylon en gehybridiseerd met de P 32-gelabelde 1,8 kilobase probe.

Drie probes om het intacte chromosoom 3 van 1,1 megabase, het T153-translocatiechromosoom van 15,8 megabase, het T315-translocatiechromosoom van 0,6 megabase en het intacte chromosoom 3 van 0,3 megabase te visualiseren. Baan A is de ouderlijke diploïde. Baan B is een his+ niet-reciproque translocatie-recombinant en baan C is een his+ reciproque translocatie-recombinant.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de frequentie van translocatievorming kan worden bepaald na meervoudige ho-gestimuleerde dubbelstrengsbreuken.