Het creëren van voorbijgaande celmembraan poriën met een standaard inkjetprinter

Het algemene doel van deze procedure is om met behulp van inkjetprinten tijdelijke poriën in celmembranen te creëren. Dit wordt bereikt door eerst een standaard inkjetprinter aan te passen. De tweede stap is het legen en reinigen van een standaard inktcartridge voor de printer om de invoering van de bio-inkt mogelijk te maken.

Vervolgens worden de relevante cellen gesuspendeerd in een oplossing van fluorescent gelabelde actine-monomeren en PBS om de bio-inktoplossing te maken. De laatste stap is het printen van de bio-inkt op microscoopglasplaten met behulp van de aangepaste printer en cartridge. Uiteindelijk kan fluorescentiemicroscopie worden gebruikt om aan te tonen dat de Fluor four-geconjugeerde G-actine-monomeren door de geprinte cellen zijn geïnternaliseerd via tijdelijke membraanporiën.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van standaard transfectie- en celmicroinjectietechnieken is dat deze printtechniek eenvoudig in gebruik is en een hoge cellevensvatbaarheid oplevert. Hoewel deze techniek inzicht kan bieden in de genetica, kan zij ook worden toegepast op andere vakgebieden, zoals de celbiofysica en tissue engineering in de celbiofysica. Deze techniek kan worden gebruikt om het cytoskelet van een cel tijdens celmigratie eenvoudig te observeren.

We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we veranderingen in de organisatie van het cytoskelet wilden kunnen visualiseren als gevolg van uitgeoefende krachten op cellen. Begin met het lossen van de plastic klemmen aan de onderzijde van de printer en til vervolgens voorzichtig de bovenste plastic behuizing omhoog. Koppel daarna het lichtpaneel van het knoppendisplay los van de bovenkant van de printer, waarbij de verbinding met het moederbord van de printer behouden blijft.

Gebruik Kim wipes en ethanol. Maak de binnenkant van de printer schoon, met name de gebieden waar de inktcartridge rust en waar het printen plaatsvindt. Zoek vervolgens de kabel die de stroomvoorziening voor de papieraanvoermechanismen van de HP desk Jet 500 verzorgt.

Ze bevinden zich net onder het papierlade aan de linkerkant van de voorzijde; trek de kabels uit het moederbord. Lokaliseer nu het papierdetectiemechanisme en bevestig een ijzerdraadlus aan de grijze plastic hendel boven en achter het papieraanvoermechanisme om als handmatig handvat te dienen, en plaats hier een platform. De schuimrubberen transporthouder voor 15 centrifugebuizen wordt gebruikt met verschillende microscoopglaasjes die met tape op hun plek zijn bevestigd in het printgebied voor het papieraanvoermechanisme, om de gewenste printglaasjes op een niveau net onder de printkop van de cartridge te brengen.

Plaats ten slotte de printer in een laminaire flowkast om een aseptische techniek te waarborgen. Begin met het verwijderen van de cartridge uit de verpakking, waarbij de beschermende tape over de printercontacten en de printkop moet blijven zitten. Stabiliseer de behuizing van de cartridge met een klem, waarbij de groene bovenkant vrij moet blijven van obstakels, en gebruik een handmatige roterende snijmachine.

Snijd de groene bovenkant van de cartridge af, giet alle resterende inkt uit het reservoir en verwijder vervolgens de plastic beschermband die de printercontacten en de printkop bedekt. Tijdens dit proces zal er waarschijnlijk water uit de printkop lekken, maar dit zal de cartridge niet beschadigen. Wanneer het water helder is, laat u de cartridge drogen.

Om een schone printomgeving te behouden, begint u hiermee door de cartridge volledig onder te dompelen in een bekerglas gevuld met gedeïoniseerd water, waarna u de cartridge 15 minuten lang soniceert. Verwijder na sonisatie de cartridge en schud het overtollige water eruit. Spray 70% ethanol in de cartridge om een sterielere omgeving te creëren.

Centrifugeer na het oogsten van de gewenste cellen deze in vijf milliliter vers medium in een conische centrifugebuis van 15 milliliter gedurende vijf minuten bij 250 ×g bij kamertemperatuur. Aspireer vervolgens het medium en resuspendeer de cellen daarna bij 1 × 10⁵ cellen per milliliter in een vers bereide fluorescente G actine-stockoplossing. Let bij het maken van de bio-inkt op dat 250 µL bio-inkt drie dekglasjes print met het hier getoonde lijnpatroon. Nadat de printer is ingeschakeld en is opgewarmd, plaatst u het gewenste printoppervlak hier; dekglasjes van 22 millimeter bij 22 millimeter worden gebruikt in het midden van de eerder geassembleerde tafel.

Open vervolgens een tekenprogramma en selecteer het gewenste patroon. Pipetteer nu ongeveer 100 tot 120 µL van de celstroom in de kleine ronde put onderaan het patrooncompartiment. Print het bestand; terwijl de printer opnieuw opwarmt, beweegt de cartridge naar de gereedpositie.

Wanneer de cartridge zich iets naar links van de inktdruppelbak beweegt en daar blijft staan, trek dan aan het papieraanvoermechanisme en de draad, waarna het printen begint. De printer print op het dekglas dat in het midden van het printplatform is geplaatst, met behulp van een HP DeskJet 500-printer met een bio-inkt bestaande uit een fibroblastcellesuspensie in een G-actine-monomeeroplossing.

Binnen een HP 26-serie werden inktcartridgecellen geprint op glazen microscoopdekglaasjes. Deze figuur illustreert een representatief resultaat van geprinte fibroblastcellen die geïncorporeerde fluorescerende actine-monomeren vertonen. Dit patroon werd in de vorige figuur gebruikt om een continue lijn van de printoplossing over het grootste deel van het microscoopglaasje te creëren.

In deze figuur wordt de rechte lijn getoond waarin de biolink en cellen wederzijds zijn gedeponeerd. Let op dat er direct na het printen een toename van de achtergrondfluorescentie is, omdat de biolink-oplossing waarin de cellen zijn gesuspendeerd vrije overtollige fluorescerende actine-monomeren bevat; het incuberen van de cellen gedurende ongeveer 10 minuten na het printen bevordert de adhesie aan het objectglas, waardoor de overtollige monomeeroplossing met vers groeimedium van het substraat kan worden gewassen, wat de achtergrondfluorescentie aanzienlijk vermindert. Hier wordt een representatieve afbeelding getoond van drie T3-fibroblasten die in een gelokaliseerde printzone zijn geprint; deze fluorescentiemicroscopische fotomicrografie van een cel, genomen 15 minuten na het printen, toont actine in het groen, de nucleus in het blauu en de overlay van zowel de G-actine als de nucleaire kleurstof.

De volgende twee afbeeldingen tonen fluorescentiemicroscopie van twee fibroblasten in een lijnpatroon drie uur na het printen. Deze eerste afbeelding toont fluorescentielabelled actine-monomeren in de cellen. Deze tweede afbeelding is een overlay van het fluorescentiekanaal met de achtergrondafbeelding om aan te tonen dat, hoewel er mogelijk wat debris op de objectglasplaat in de linkerbenedenhoek aanwezig is, dit niet fluoresceert.

Ten slotte wordt hier een controlegroep van niet-geprinte cellen gepresenteerd, die drie uur lang zijn geïncubeerd met fluorescentie-gelabelde monomeren, om aan te tonen dat monomeren het celmembraan niet kunnen penetreren zonder membraanpermeabilisatie door celprinten. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om meerdere cartridges gereinigd en klaar voor gebruik te hebben, aangezien het verstoppen van de printer een van de problemen is die deze techniek vertragen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe een standaard desktopprinter kan worden omgebouwd om levende cellen te printen, wat helpt bij het creëren van een tijdelijke membraankracht.