Lensless fluorescentie microscopie op een chip

Het algemene doel van deze procedure is om een lensloos fluorescent microscopieplatform op een chip te demonstreren voor het beelden van fluorescerende objecten over een ultrabreed gezichtsveld. Om dit te bereiken, worden een dun absorptiefilter en een glasvezelplaat voorzichtig bovenop een opto-elektrische sensorarray, of CCDC-mos, geplaatst, waarna een microfluïdische chip bovenop de glasvezelplaat wordt gepositioneerd. Vervolgens wordt een prisma met de microchip samengevoegd met behulp van indexaanpassingsolie.

Fluorescente excitatie vindt plaats via de zijvlakte van een rhomboïder prisma en de holografische belichting geschiedt via de bovenvlakte van hetzelfde prisma. Uiteindelijk kunnen er hoge-resolutie microscopische beelden worden verkregen uit de verworven fluorescentiebeelden door de ruwe beelden via digitale algoritmen te decoderen. Indien nodig kunnen de gedecodeerde fluorescentie-objecten automatisch worden geteld met behulp van een speciaal ontwikkelde interface.

On-chip lens. Beeldvorming is over het algemeen gericht op het vervangen van omvangrijke lensgebaseerde optische microscopen door eenvoudigere en compactere ontwerpen. Dit opkomende technologieplatform heeft het potentieel om de noodzaak van omvangrijke en kostbare optische componenten weg te nemen met behulp van nieuwe theorieën en digitale reconstructie-algoritmen.

De lenzenlijst op het on-chip beeldbewerkingsplatform bestaat uit verschillende optische componenten, waaronder een digitale sensorarray, een incoherente verlichtingsbron, een prisma, een absorptiefilter en een glasvezelplaat of een glasvezeltaper. In dit platform kunnen verschillende typen sensorarrays worden gebruikt voor de detectie van het fluorescentiesignaal van doelwit-micro-objecten. Voor de doeleinden van deze video wordt een charge-coupled device gebruikt; een incoherente lichtbron, zoals een eenvoudige lichtemitterende diode, wordt gebruikt voor fluorescentie-excitatie.

Twee verschillende excitatiefiltermethoden worden parallel gebruikt om de vereiste donkerveldachtergrond te creëren, zoals getoond in dit diagram. Ten eerste wordt een glazen prisma of een glazen halve bol gebruikt om totale interne reflectie (TIR) te genereren aan het onderste oppervlak van de microfluïdische chip waarin de betreffende monsters zich bevinden. Parallel hieraan wordt een goedkoop absorptiefilter gebruikt om het zwak verstrooide excitatielicht te verwijderen dat het TIR-proces niet volgt.

Na een succesvolle onderdrukking van de excitatie via deze twee mechanismen wordt op het detectielevel enkel de fluorescentie-emissie van de monsters vastgelegd. Ondanks een dergelijke grote numerieke apertuur van de detectie worden de ruwe fluorescentievlekken op de sensorarray vrij breed gemaakt om de ruimtelijke spreiding van dit fluorescentiesignaal beter te kunnen sturen en controleren. In plaats van een reguliere faceplate wordt er een glasvezel-faceplate geplaatst tussen het object- en het sensorvlak.

Een taps toelopende glasvezelplaat, die een aanzienlijk hogere dichtheid aan glasvezelkabels op de bovenste facet heeft in vergelijking met de onderste, kan worden gebruikt voor beeldvorming met een hogere resolutie door middel van vergroting. De microfluïdische chips die in dit platform worden gebruikt, zijn vervaardigd met behulp van polydimethylsiloxaan-wanden op glasplaatjes om de microkanalen te creëren die nodig zijn voor on-chip beeldvorming om de assemblage van het lensloze on-chip beeldvormingsplatform te beginnen. Verwijder eerst het dekglas van de opto-elektronische sensorarray met een vacuümpen en plaats voorzichtig een dun absorptiefilter op de bovenkant van het actieve gebied van de detector.

Plaats een glasvezel-frontplaat bovenop dit absorptiefilter. Plaats vervolgens de vervaardigde microfluïdische chip direct bovenop de glasvezelarray. Daarna wordt een glazen prisma boven de microfluïdische chip gemonteerd met behulp van index-matching olie, zodat de brekingsindex van de interface overeenkomt met de brekingsindex van het glas.

Verbind de lichtbronnen met glasvezelkabels door middel van FC-connectoren. Een van de meest uitdagende aspecten van deze procedure is de uitlijning van de componenten. Lijn de afstanden tussen de componenten, de positie en de hoek van de verlichting zorgvuldig uit.

Verplaats tenslotte de zijverlichtingsvezel dichter naar het prisma en pas de hoek aan om te garanderen dat er totale interne reflectie optreedt bij de glas-luchtinterface die overeenkomt met de microfluïdische chips. Met dit on-chip platform kunnen het onderste substraat, diverse cellen of kleine diermodellen worden afgebeeld, maar voor de doeleinden van deze demonstratie zullen witte bloedcellen worden afgebeeld. Om de witte bloedcellen te labelen met een fluorescerende kleurstof, mengt u eerst ongeveer 100 µL volbloed met ongeveer 1 mL spoelbuffer voor rode bloedcellen, incubeert u dit gedurende ongeveer drie minuten bij kamertemperatuur en centrifugeert u vervolgens de lysed bloedoplossing.

Verwijder de bovenste laag met een micropipet en resuspendeer de pelletlaag in fosfaatgebufferde zoutoplossing om het nucleïnezuur van de cellen te labelen met fluorescerende kleurstof. Voeg SYTO 16 toe aan de resuspensie en incubeer het monster vervolgens gedurende ongeveer 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Centrifugeer het gelabelde monster na 30 minuten. Verwijder het supernatant om de achtergrondruis door fluorescentie-emissie van ongebonden kleurstoffen te verminderen.

Reese heeft de laag van het witte bloedcelpellet opgesuspendeerd in ongeveer vijf milliliter PBS. Het monster is nu klaar om in de microfluïdische chip te worden geladen voor lensvrije fluorescentie-imaging op de chip. Voordat de witte bloedcellen worden geïmagined, moet het imagingplatform worden gekalibreerd met behulp van fluorescerende microbeads.

Bereid een verdund microbead-monster voor met gebruik van gedeïoniseerd water en de onverdunde bead-oplossing. Injecteer dit initiële monster met een scherpe naaldspuit in de microfluïdische chip vanaf de zijde van de PDMS-wanden.

Nadat de componenten zijn geassembleerd om on-chip fluorescentie-imaging te realiseren, worden ruwe beelden van fluorescente beads verkregen via een computer met de speciaal ontwikkelde LabVIEW-interface. Controleer of er ten minste 20 geïsoleerde beelden van fluorescente beads aanwezig zijn over het gehele gezichtsveld. Sla de kalibratiegegevens op; deze worden later gebruikt om de point spread-functie van het lensloze fluorescentiemicroscopieplatform te kalibreren en te extraheren.

Verwijder de microfluïdische chip die het monster met fluorescerende kraaltjes bevat en koppel het prisma los van deze chip. Injecteer het eerder voorbereide monster met witte bloedcellen in een andere ongebruikte microfluïdische chip via de zijde van de PDMS-wanden. Stel de componenten opnieuw samen onder dezelfde experimentele omstandigheden, met name wat betreft de afstanden en het excitatievermogen.

Verkrijg de ruwe beelden van witte bloedcellen met behulp van de op maat gemaakte LabVIEW-installatie, waarbij dezelfde softwareparameters worden gebruikt als voor de fluorescente microbeads. De kalibratiedata en de ruwe beelden van de witte bloedcellen worden vervolgens gebruikt om in MATLAB via digitale verwerking beelden met een hogere resolutie te creëren. Ter vergelijking worden hier representatieve resultaten getoond van wide-field lens fluorescente on-chip beeldvorming van een mengsel met groene fluorescente deeltjes van 4 µm en 10 µm, 10x microscoop.

Er worden ook objectieffoto's verstrekt, die goed overeenstemmen met de getoonde lensloze fluorescentiebeelden. Vervolgens worden de resultaten getoond van lensloze fluorescentiebeeldvorming in breedveld van een mengsel met 10 micron groene en 10 micron rode fluorescerende deeltjes. De lensloze fluorescentiebeelden vertonen een goede overeenstemming met de 10x microscoopobjectieffoto's van dezelfde monsters.

Deze figuur biedt een prestatievergelijking van de Lucy Richardson-deconvolutie en compressieve sampling op basis van decoderingsalgoritmen voor de beeldvorming van verschillende paren kralen van 10 micron. De bovenste rij illustreert de ruwe fluorescente beelden zonder lens, waarbij de inzetstukken de microscoopvergelijkingen tonen van dezelfde deeltjes die met een 10x objectief vereist zijn. De middelste rij demonstreert de resultaten van de compressieve decodering, terwijl de onderste rij de resultaten van de Lucy Richardson-deconvolutie illustreert. DDCS en DLR verwijzen respectievelijk naar de centrum-tot-centrumafstanden en microscoopbeelden, CS-gedecodeerde lensbeelden en LR-gedeconvolueerde beelden zonder lens.

Vervolgens wordt de digitale verwerking van de minder fluorescente ruwe beelden van de lens geïllustreerd. Er wordt gebruikgemaakt van een algoritme op basis van compressieve steekproeven om een ruimtelijke resolutie van minder dan vier micron te bereiken door nauw opeengepakte paren kralen met een diameter van twee micron te onderscheiden. De insets tonen vergelijkingen met een 40 x microscoopobjectief, die zeer goed overeenstemmen met de gedecodeerde fluorescente beelden.

Hier verwijst D naar de hart-op-hart afstanden in microscoopbeelden. Terwijl DCS verwijst naar de hart-op-hart afstanden in de CS-gedecodeerde, lensloze beelden. Deze figuur toont de resultaten van lensloze beeldvorming van fluorescentie-gelabelde witte bloedcellen.

De ruwe lensvrije beelden worden snel gedecodeerd met behulp van een op CS gebaseerde decoder, wat zeer goed overeenkomt met een conventioneel microscoopbeeld van hetzelfde monster dat is verkregen met een 10 x objectieflens. Naast beeldvorming kunnen de gedecodeerde fluorescentie-objecten, indien gewenst, ook automatisch worden geteld met behulp van een speciaal ontwikkelde interface voor on-chip cytometrie-toepassingen. Hier wordt een op maat ontworpen, geautomatiseerde interface voor het tellen van fluorescentie-objecten in Matlab geïllustreerd. We hebben zojuist de procedure gedemonstreerd voor lensvrije fluorescentiemicroscopie van gelabelde cellen en microbeads over een gezichtsveld van acht vierkante centimeter.

Een dergelijk geïntegreerd imagingplatform op een chip, ondersteund door een snelle compressieve decoder, zal zeer veelzijdig zijn voor toepassingen in high-throughput cytometrie, analyse van zeldzame micro-events en onderzoek aan levende cellen.