Cel Capture Met behulp van een apparaat Microfluïdische

De apparaten zoals wij ze hebben voorbereid, zijn verpakt in kits van 10 of 20 stuks. Bij levering worden ze gekoeld verzonden in een doos en bevat de kit alle componenten die nodig zijn om het experiment uit te voeren. De kit bevat een pakket met alle spuiten en buffers, die op kamertemperatuur bewaard kunnen worden. Er is ook een kopie van het protocol aanwezig dat we in dit experiment zullen volgen.

Er is ook een koelbox, waarin de eigenlijke apparaten en alle loopbuffers die gekoeld bewaard moeten worden, zitten. Normaal gesproken worden kits verpakt in groepen van 10 of 20. Wanneer de kits niet in gebruik zijn, moeten ze in de koelkast worden bewaard.

Elke spuit en elk kitcomponent is zorgvuldig gelabeld en de labels komen overeen met de tabel in het protocol dat we volgen. Zo is er geen ambiguïteit over welke spuit of welk kitcomponent in de individuele stappen moet worden gebruikt. Na het uitpakken van de apparaten en het plaatsen hiervan in een biologische veiligheidskabinet, zullen we de procedure uitvoeren voor het isoleren van de neutrofielen en het lyseren ervan voor downstream genomische toepassingen, omdat het cellysaat dat we verkrijgen zal worden gebruikt voor isolatie of we zullen het RNA uit het cellysaat extraheren.

Daarom willen we ervoor zorgen dat ons werkgebied schoon is, niet alleen in steriele zin, maar ook vrij van RNA's die gewoonlijk in de omgeving aanwezig zijn. Het is daarom zeer belangrijk om het hele werkgebied en al je apparaten af te nemen met een oplossing die RNA's afbreekt. Gewoonlijk nemen we alle instrumenten en werkoppervlakken af met RNA SAP of RNase-away, die verkrijgbaar zijn bij verschillende fabrikanten.

Het apparaat wordt geleverd in een hittegesealde zak. Elk apparaat is verzegeld en voorzien van een barcode. U dient deze barcode te noteren indien u met klinische monsters werkt.

Het apparaat is nu verzegeld, de afdekking is verwijderd en het is in het pomphouder-manifoldapparaat geplaatst. Het bloedmonster dat we gebruiken is een monster volbloed. We gaan dit door een standaard 1 ml BD-spuit laten stromen, en deze is gelabeld als spuit één.

Normaal gesproken wordt de spuit uit de verpakking gehaald en wordt de dop voorzichtig van de bloedbuis verwijderd. Vervolgens neem je 700 µL of 0,7 ml bloed en injecteer je de helft daarvan, oftewel 350 µL, in een buisje van 1,5 ml. Op deze manier kan het bloed worden doorgegeven voor verdere verwerking.

Uw bloedbuisje kan worden doorgegeven en u heeft nog steeds bloed over in het geval dat het apparaat uitvalt. Wat we nu gaan doen, is de spuit met bloed laden op deze naald, die via een stukje slang aan dit apparaat is verbonden. We moeten zeer voorzichtig zijn met het microfluïdische isolatieapparaat.

We moeten er zeer zorgvuldig op toezien dat er geen luchtbellen in het apparaat terechtkomen, anders zal het apparaat niet goed functioneren. Meestal doen we het volgende: we nemen de spuit, drukken op de zuiger en voegen de vloeistof toe aan het bovenste oppervlak van het apparaat, waarbij we ervoor zorgen dat het volledig bevochtigd is voordat we alle vloeistof hebben uitgestoten. We stoppen dan en verwijderen voorzichtig de spuitbehuizing van de naald en vullen in feite de naaldpunt of de luer-connector van de naald met de resterende buffer die in deze spuit zit.

We voeren dit af. Vervolgens nemen we de spuit met bloed en plaatsen we deze in deze Luer-lock aansluiting. We doen dit voorzichtig om te voorkomen dat er bloed morst of dat er luchtbellen worden geïntroduceerd.

Houd de behuizing van de spuit en de slang bij voorkeur vast met een klem voor het geval er bloed wordt gemorst. Zodra de spuit is verbonden met de slangbehuizing of de naald, tikken we er een paar keer kort tegenaan om eventuele luchtbellen bij de connector te verwijderen. Deze spuit wordt vervolgens in de spuitpomp geplaatst en met de borgschroef vastgezet.

De spuitpomp wordt ingeschakeld en is al vooraf ingesteld op onze stroomcondities. We gaan dit bloed met een snelheid van 30 µL per minuut door het apparaat laten stromen. Zodra de spuitbehuizing in de spuitpomp is geplaatst, drukken we op de knop van de beweegbare zuigerarm en schuiven we deze naar beneden tot deze de bovenkant van de zuiger raakt en vloeistof door de tip begint te persen.

Het is een stompe tip, een naald van roestvrij staal. Zodra we weten dat het systeem is voorbereid, zullen we op 'run' drukken. Om de bloedstroom te starten, drukt u op 'stop' om deze te stoppen, en vervolgens neemt u een schone centrifugebuis van 1,5 ml of een Fendor-buis en trekken we de verbinding voorzichtig los.

Koppel er slechts één los, trek de slang uit één poort van het apparaat. Zodra deze slang is losgekoppeld, steken we deze in de 1,5 ml fendor-buis. We drukken op start om de bloedstroom weer te laten lopen.

Zodra we zien dat er een bloeddruppel wordt gevormd, stoppen we de pomp en brengen we deze in de inlaat die we zojuist in het apparaat hebben geopend. We drukken op 'run' om de bloedstroom te starten en stellen een timer in op vijf minuten. We willen ervoor zorgen dat het bloed alle kamers gelijkmatig vult en dat er geen zichtbare luchtbellen in het apparaat zitten.

Als er luchtbellen zijn die de doorstroming naar een van de kamers blokkeren, kunt u een pincet gebruiken en dit langs de kleine kanaaltjes leiden die naar de vangkamers leiden of de kleine kanaaltjes die uit de vangkamers komen. Dit apparaat vult zich goed, dus na vijf minuten drukt u op stop op de spuitpomp om de bloedstroom te stoppen, maakt u de klem van de spuit los en haalt u deze uit de houder van de spuitpomp. Vervolgens gebruiken we spuit nummer drie, die is gevuld met nuclease-vrij PBS. We gaan in feite opnieuw controleren of het oppervlak van het apparaat bevochtigd is om luchtbellen te voorkomen; we tikken tegen de spuit om er zeker van te zijn dat eventuele luchtbellen zich bovenin de spuitbehuizing bevinden.

Maak de arm van de spuitpomp los en plaats de spuit van drie milliliter in de pomp. Draai deze vast en duw vervolgens de zuiger naar beneden tot deze contact maakt met de zuiger van de spuit. We starten de run en wachten tot de vloeistof het apparaat heeft geprimed en er een druppel aan de punt van de roestvrijstalen naald verschijnt.

Zodra u ziet dat er een druppel wordt gevormd, stopt u de pomp. We verwijderen vervolgens de roestvrijstalen tip die het bloed bevat. Daarna voegen we de wasbuffer toe en drukken we op run.

We laten dit vijf minuten lopen. Gebruik een schoon wisje om eventuele kleine hoeveelheden bloed bij de inlaat of uitlaat weg te vegen. Na vijf minuten spoelen met washbuffer moet het apparaat volledig vrij zijn van bloed; dit is zichtbaar doordat er geen rood bloed meer in het apparaat aanwezig is en het apparaat er helder uitziet. Na deze vijf minuten stoppen we met het doorvoeren van de washbuffer.

Vervolgens halen we de spuit van de spuitpomp af. We sluiten het microcentrifugebuisje van 1,5 ml af, direct op de flexibele uitlaatslang. Daarna tillen we het microcentrifugebuisje voorzichtig op, terwijl we de afvalslang uit het apparaat trekken.

We gooien dit weg in een container voor biologisch gevaarlijk afval. In de kit zit een nieuwe uitlaatslang, die eigenlijk van Teflon is gemaakt. Deze is wederom voorzien van een roestvrijstalen tip.

We gaan de oude uitlaatslang vervangen door deze nieuwe uitlaatslang. We nemen die uitlaatslang en proberen deze in een soort U- of V-vorm te buigen. Ook zit er een Kaya shredder-kolom in de kit; deze fragmenteert DNA en homogeniseert in feite uw cellijn.

We openen de paarse dop van de shredderkolom en plaatsen de uitlaatslang in de Kay Shredder-kolom. We pakken uit de kit spuit nummer twee, waarvoor staat dat deze voor RLT gebruikt moet worden. Dit is een standaard BD 1 ml spuit met een 22 gauge stompe roestvrijstalen naald.

We gebruiken dit om 350 µL standaard RLT van Kyogen in het apparaat te injecteren. Omdat het apparaat een dood volume van ongeveer 50 µL heeft, injecteren we het RLT, gevolgd door een luchtbel, om dit dode volume van het apparaat in de chi-shredderkolom te drukken. Dit doen we door met de spuit eerst 350 µL lucht op te zuigen, gevolgd door 350 µL of 0,35 ml RLT, zodat het RLT zich nu onderaan in de spuit bevindt.

Weersta de neiging om de spuit om te keren en de lucht te injecteren. De lucht is aanwezig om ervoor te zorgen dat alle RLT in onze Kay shredder-kolom terechtkomt. We gaan nu de slang van de wasbuffer verwijderen.

We plaatsen de spuit met de RLT en injecteren de RLT langzaam in het apparaat over een periode van ongeveer 30 seconden, waarbij we ervoor zorgen dat de uitlaatslang het afval in de chi-shredderkolom loost. Zodra er lucht in het apparaat wordt geïnjecteerd, drukt u op de plunjer en wacht u tot alle vloeistof in de Kay-shredderkolom is geloosd. We nemen de kay-shredderkolom en centrifugeren deze in een microcentrifuge met een tegengewicht bij 15.000 RPM of het maximale toerental van een benchtop-microcentrifuge gedurende twee minuten.

Nadat de kolom twee minuten is gecentrifugeerd, halen we het monster eruit, dat nu in RLT zit, en plaatsen we dit in een van de meegeleverde cryovials met paarse dop. Als u met een klinisch monster werkt, labelt u deze cryovials aan het begin van het experiment. Hier is het lysaat in de cryovial.

Dit cryovial wordt onmiddellijk in een vriezer van -80 °C geplaatst en bewaard voor verzending of latere RNA-extractie. Dit is een alternatief protocol voor de isolatie van neutrofielen. In plaats van de cellen te lyseren met RLT-buffer, gaan we ze kleuren met een standaard histologische kleuring.

Een kleuring. We halen het verzegelde apparaat uit de zak en pakken het uit, noteren het lotnummer van het apparaat en plaatsen de Petrischaal in de Petrischaalhouder.

We nemen de spuit van 1 ml uit de verpakking, spuit nummer één, vullen deze met 700 µL bloed en injecteren de helft hiervan, 350 µL, in een eend DPH-buis. Deze leggen we apart. Neem spuit vier, die is voorzien van de slang die we zullen gebruiken voor de selectie, en injecteer het bloed in het apparaat.

Houd de basis van de naald bij het uiteinde van de slang op een chemische wijze vast. Verwijder de spuitbehuizing en vul de luer. De adapter dient ter buffering en de spuit wordt vervolgens afgevoerd.

We plaatsen de spuit met bloed in de naald en gebruiken een chemisch doekje om eventuele morsingen op te vangen. We tikken tegen de spuit om luchtbellen bij de verbinding tussen de naald en de spuitbehuizing te verwijderen. We plaatsen de spuit in de spuitenpomp en primen de slang door op de bewegende arm van de spuitenpomp te drukken.

We koppelen de slang los van een van de uitgangen van het apparaat, het opvangknoppelingstoestel, en plaatsen deze in een 1,5 ml Eppendorf-buisje. Vervolgens starten we de bloedstroom door op 'run' te drukken op de spuitenpomp. We wachten tot er een bloeddruppel wordt gevormd bij de roestvrijstalen tip.

Zodra de druppel is gevormd, drukt u op stop, dept u het bloed weg, plaatst u het in het apparaat en drukt u op run. We zetten nu een timer voor vijf minuten. Oké, nadat het vijf minuten door het apparaat heeft gestroomd, drukt u op stop op de spuitenpomp en laat u de spuit los.

Vervolgens vervangen we die spuit door de 3 ml spuit met onze wasbuffer, wat in dit geval 1x PBS is. Zorg er opnieuw voor dat de bovenkant van het apparaat goed is afgesloten en verwijder dan de naaldpunt die bloed of plus run bevat. Begin met het primen van het apparaat.

Zodra de druppelvormen zijn gevormd, plaatsen we deze in het apparaat en drukken we op start. Dep eventueel bloed bij de inlaat of de uitlaatslang weg en laat dit vijf minuten stromen na de wasstap. Stop vervolgens opnieuw de spuitpomp en verwijder de spuit uit de pomphouder. Voor standaard GIM-kleuring zullen we de cellen eerst fixeren en dehydrateren met 100% methanol.

We hebben een spuit, een spuit van 3 mL vooraf gevuld met methanol. We gaan de spuit opnieuw ontluchten om te controleren of de methanol stroomt, de spuitpomp stopzetten, deze in het apparaat plaatsen en op run drukken. We gaan ze twee tot vier minuten fixeren in deze methanoloplossing.

Na twee tot vier minuten fixeren en methanolbehandeling stoppen we de pomp, spoelen we de spuit schoon met methanol en laden we vervolgens een spuit van 3 mL met EEM Sustain-standaard van Sigma, verdund 1:5 in gedeïoniseerd water. Na het verdunnen hebben we dit in de spuit geladen en hebben we aan het uiteinde van de spuit een filter van 0,8 micron bevestigd om eventuele deeltjes te filteren die het apparaat zouden kunnen verstoppen. De kleuring duurt vijf tot 10 minuten.

Vervolgens spoelen we met gedeïoniseerd water. Na vijf tot 10 minuten kleuren stoppen we de spuitpomp en vervangen we de spuit met de kleuringsbuffer door de spuit met gedeïoniseerd water; we spoelen in feite door totdat we zien dat de blauwe kleur van de SAI uit het apparaat is weggespoeld. Zodra het overtollige gim sustain uit het apparaat is gespoeld, stoppen we de wasoplossing.

Vervolgens verwijderen we de waterspuit uit de inlaat. Daarna nemen we de uitlaatslang van het apparaat en pakken we het uiteinde van deze slang vast met de pincet.

Dit is een flexibele tigon-slang en we gaan deze terugplaatsen in de inlaat van het apparaat. Dit verzegelt het apparaat en houdt de cellen gehydrateerd en hun morfologie intact. Nu zal mijn collega, Dr. John Hong Chang, een alternatief protocol laten zien voor de isolatie van CD4-positieve lymfocyten, gevolgd door immunofluorescente kleuring direct in het microfluïdische apparaat.

Mijn naam is Shong Hong en vandaag ga ik u celkleuring in een microfluïdisch apparaat demonstreren. In een eerder stadium heb ik u al laten zien hoe u een microfluïdisch immunoaffiniteits-isolatieapparaat kunt gebruiken om specifiek bloedcellen uit onbehandeld volbloed te isoleren. Voor dat doel wilde men de cellen lyseren om de eiwit- en DNA-inhoud van die geïsoleerde cellen te verkrijgen. Voor mijn eigen onderzoek ben ik echter geïnteresseerd in het verkrijgen van de cellen om vervolgens de celhoeveelheid te bepalen, bijvoorbeeld om de CD4-celcount uit volbloed te verkrijgen en dit te gebruiken als indicator voor diagnostische doeleinden.

Het gebruikte apparaat is zeer vergelijkbaar met het apparaat van Ken. Het is gemaakt van een rechte kamer van PDMS. De geometrie is iets anders, waardoor de operationele parameters enigszins verschillen, hoewel de algemene operationele procedure in grote lijnen zeer vergelijkbaar is.

Ik sla daarom alle stappen voor het opvangen en spoelen van cellen over en ga direct over naar de stap van het kleuren van de cellen in de celtelprocedures. Hier heb ik een apparaat waarin al cellen uit全bloed zijn opgevangen en dat al is gespoeld met PBS. De ongewenste cellen zijn dus al uit het apparaat gespoeld en ik heb vooraf een antilichaammengsel bereid dat specifiek wordt gebruikt om de cellen te labelen die in het apparaat zijn geïsoleerd.

De antilichaamconcentratie die we hier hebben gebruikt, is geoptimaliseerd voor het kleuren van de cellen met een zeer hoge fluorescentie-intensiteit onder een fluorescentiemicroscoop. De procedure is vrij eenvoudig. We plaatsen de spuit gevuld met de antilichaamoplossing op de spuitpomp en controleren vervolgens of de stroomsnelheid is ingesteld op de juiste parameters die we nodig hebben.

Vervolgens starten we de spuitpomp en controleren we het uiteinde van de slang om er zeker van te zijn dat de oplossing al uitstroomt, zodat er geen luchtbellen meer in de slang zitten. Daarna kunnen we de slang aansluiten op het microfluïdische device waarin de cellen zijn vastgelegd. De antilichamen stromen nu het device in om de cellen te kleuren die we in het device hebben geïsoleerd. Voor de stroomsnelheid gebruik ik hier 5 µL per minuut, maar afhankelijk van de geometrie van het device kunnen er verschillende stroomparameters zijn die u voor uw specifieke doeleinden wilt gebruiken.

Vervolgens laten we de antilichaamoplossing vijf minuten lang doorstromen, wat voldoende volume is om alle vloeistof in het microkanaal te vervangen. Na de injectie van de antilichamen stoppen we de stroming. We laten de antilichamen dus gedurende vijf minuten met een snelheid van 5 µL per minuut doorstromen om alle vloeistof in het microkanaal te vervangen.

Daarna stoppen we de flow en laten we het apparaat 30 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Dit dient in het donker te gebeuren, omdat fluorescerende antilichamen kunnen uitbleken terwijl de cellen worden geïncubeerd met een kleuringsantilichaam. Na een kleuring van gewoonlijk 15 tot 30 minuten koppelen we de slang eenvoudig los van het apparaat en vervangen we de spuit met antilichamen door een spuit met buffer om ongebonden antilichamen uit het apparaat weg te spoelen.

De wasoplossing bevat hier 1% BSA in een PBS-oplossing. BSA wordt gebruikt om aspecifieke binding van antilichamen op het oppervlak te blokkeren en dat is ook wat wij zullen doen. Eerst stellen we de stroomsnelheid van de spuitpomp in om er zeker van te zijn dat deze de gewenste snelheid heeft, waarna we de spuitpomp starten en controleren of er daadwerkelijk vloeistof uit de slang komt voordat we deze op het apparaat aansluiten.

Het doel hiervan is om te voorkomen dat er luchtbellen in de slang achterblijven. Zo gaat er geen luchtbel het apparaat in bij het injecteren. We sluiten de slang vervolgens aan op het apparaat en laten het nog vijf minuten doorstromen om alle ongebonden antilichamen uit het apparaat weg te spoelen.

Na de wasstap fixeren we de cellen met 1% PFA. Het doel hiervan is zodat het apparaat enkele weken bewaard kan worden, indien de beeldvorming niet direct kan worden uitgevoerd. De procedure is dus vrij eenvoudig.

Dit is vergelijkbaar met wat we eerder hebben gedaan. We plaatsen de spuit in de pomp, stellen de stroomsnelheid in op de gewenste waarde en starten vervolgens de spuitpomp. Daarna sluiten we de slang aan op ons apparaat om de paraform IDE-oplossing, het fixatiemiddel, in het apparaat te injecteren om de cellen te fixeren. Ook nu laten we dit ongeveer vijf minuten doorstromen.

PFA vervangt dus alle buffer in het apparaat om alle cellen in het apparaat te fixeren. Na de fixatiestap met PFA verwijderen we simpelweg de PFA-spuit en is het apparaat klaar voor beeldvorming. In sommige gevallen willen onderzoekers een nucleuskleuring uitvoeren om deze te kunnen overlayen met hun kleuring van celoppervlaktemarkers.

Daarom zullen we aan het einde een kernkleuring uitvoeren met DPI. We laden de DPI-spuit, zetten de spuitenpomp aan en laten de DPI door ons apparaat stromen. Nu zullen de celkernen in deze cellen gekleurd worden om de locatie van de cellen aan te tonen.

En deze DPI-kleuringsafbeelding kan later over de kleuring van de oppervlaktemarkers worden gelegd om aan te tonen waar de cellen zich bevinden. Aan het einde van de DPI-kleuring moeten we dus opnieuw de ongebonden DPI uitwassen met een bufferoplossing. Hiervoor gebruiken we opnieuw PBS met 1% BSA om de ongebonden DPI uit te wassen.

De werkwijze is vergelijkbaar met wat we eerder hebben gedaan. We plaatsen simpelweg de spuit met buffer in ons apparaat en laten de buffer door het apparaat stromen om ongebonden DAPI weg te spoelen. Dat is de volledige procedure voor het kleuren van cellen in een microfluïdisch apparaat.

Na alle kleuringsprocedures zijn de apparaten klaar voor beeldvorming. Omdat we PFA-fixatie hebben toegepast, kunnen de apparaten ook enkele weken worden bewaard als de beeldvorming niet direct kan worden uitgevoerd.