Cel Knijpen als een robuuste, Microfluidic Intracellular Delivery Platform
7 november 2013
Rapid mechanische vervorming van de cellen heeft ontpopt als een veelbelovende,-vector vrije methode voor intracellulaire levering van macromoleculen en nanomaterialen. Dit protocol biedt gedetailleerde stappen over hoe het systeem te gebruiken voor een breed scala aan toepassingen.
Het algemene doel van het valexperiment is om macromoleculen vectorvrij af te leveren aan doelcellen met behulp van mechanische verstoring. Dit wordt bereikt door eerst het doelceltype in suspensie te plaatsen met het gewenste afleveringsmateriaal en het in het reservoir van een speciaal ontworpen microfluïdisch apparaat te laden. Als tweede stap wordt het microfluïdisch apparaat onder druk gezet en worden de cellen door een reeks microfluïdische kanalen gedreven die de cellen knijpen om tijdelijke membraanverstoring te vergemakkelijken.
Vervolgens worden de cellen gedurende een bepaalde tijd in aanwezigheid van het doelafleveringsmateriaal ingecubeerd om diffuus transport van het materiaal in het celcytoplasma te vergemakkelijken. Terwijl de celmembraan wordt hersteld. Resultaten worden verkregen die effectieve aflevering van macromoleculen laten zien door het gebruik van flowcytometrie.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals ation en lipo perfectie, is dat het in staat is om uitdagende celtypen en materialen aan te pakken die niet effectief kunnen worden afgeleverd door andere methoden. Deze methode kan sleutelvraagstukken in het biologische veld beantwoorden, zoals hoe cellen re programmeren kunnen worden verbeterd. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de therapie en diagnose van kanker omdat het systeem manipulatie van immuuncellen mogelijk maakt om hun antitumor effectiviteit te verbeteren.
Om te beginnen, fabriceer of koop het microfluïdisch apparaat, apparaathouder, plastic vloeistof reservoirs en O-ringen zoals hier getoond en vermeld met details in het bijbehorende tekstprotocol, vul vervolgens drie afsluitbare containers gedeeltelijk met 70%ethanol. Plaats de apparaten in de eerste container, de reservoirs en O-ringen in de tweede container en houders in de derde. Vul vervolgens de containers voor de rest van de weg met 70%ethanol.
Plaats vervolgens de container met de reservoirs en O-ringen evenals degene met de houders in een ultrasone bad gedurende vijf tot tien minuten voor gebruik. Dit helpt om eventuele verontreinigende deeltjes uit eerdere experimenten te verwijderen terwijl de component het werkgebied in een bioveiligheidskabinet met 70%ethanol sonische afveegt. Steriliseer vervolgens al het benodigde materiaal, inclusief de drie containers en een paar pincetten, door ze af te vegen met 70%ethanol en plaats ze in het bioveiligheidskabinet om met de montage te beginnen.
Leg eerst twee tot drie weinig pluizende doekjes in het werkgebied. Verwijder vervolgens de plastic reservoirs uit de ethanolcontainer met behulp van pincetten en leg ze op de doekjes om het wegsijpelen en verdampen van ethanol van de binnenoppervlakte te vergemakkelijken. Tik voorzichtig op de reservoirs om de verwijdering van de ethanoloplossing te helpen.
Gebruik indien nodig perslucht om de reservoir volledig te ontluchten. Zodra de reservoirs droog zijn, plaats de O-ringen in de juiste gleuven op de reservoirs. Gebruik vervolgens pincetten om de chip met de kant omhoog in de apparaathouder te plaatsen.
Zorg ervoor dat de chip plat in de houder ligt en pas indien nodig aan met behulp van de pincetten. Als het apparaat niet goed past in zijn houder, bestaat het risico dat het tijdens de volgende stappen breekt. Plaats vervolgens voorzichtig de reservoirs op de houder en lijn ze uit met de clips.
Zorg ervoor dat de O-ringen niet uit hun gleuven vallen. Druk tijdens dit proces voorzichtig op de reservoirs totdat ze op hun plaats klikken. Zorg ervoor dat beide zijden van de reservoirs veilig zijn en dat de chip zich in de juiste positie lijkt te bevinden.
Druk niet met overmatige kracht op de reservoirs. Omdat de druk de chips voor primaire of adhesie kan breken. Cellijnen, plaats cellen één tot twee dagen voor het experiment zodat ze niet meer dan 80%confluent zijn.
Op de dag van het experiment. Direct voorafgaand aan het experiment, oogst de cellen en suspendeer ze in media of een andere gewenste buffer bij tussen een en tien miljoen cellen per milliliter. Haal vervolgens voorzichtig de celsuspensie door een 40 micron celzeef mesh om klonten van cellen en matrix te voorkomen die het apparaat verstoppen.
Na het zeven, meng 300 microliter van de celsuspensie met de gewenste concentratie afleveringsmateriaal in een aparte buis. Voor deze demonstratie worden twee microliters dextrine bij vijf milligram per milliliter en twee microliters Alexa. 4 88 isotoopcontrole antilichaam toegevoegd per 50 microliter celsuspensie.
Meng vervolgens voorzichtig 100 microliter van de cellen door pipetteren. Pipet vervolgens met behulp van gelbelasting tips de cellen en het afleveringsmateriaal in een van de reservoirs, bevestig drukbuis naar het gevulde reservoir en draai de knoopvinger vast om een goede plafond te garanderen. Pas vervolgens de luchtdruk aan op 70 PSI op de regulator om de snelheid te regelen waarmee cellen door het apparaat reizen.
De druk moet worden geoptimaliseerd voor de specifieke cel- en microfluïdische chipcombinatie die in elk experiment wordt gebruikt. Met alles voorbereid, breng het apparaat op ooghoogte en oriënteer het zodat de vloeistof in het reservoir gemakkelijk zichtbaar is. Druk vervolgens op de drukknop klep om het reservoir onder druk te zetten en het celstroming te beginnen.
Let op de snelheid waarmee de vloeistof uit het reservoir stroomt. Als de vloeistof aanzienlijk langzamer wordt in verhouding tot de oorspronkelijke stroomsnelheid, is het gemonteerde apparaat waarschijnlijk verstopt en moet het worden vervangen. De verhoogde schuifspanning veroorzaakt door de blokkade zal groter dan normaal celdood veroorzaken.
Wanneer het vloeistofniveau ongeveer twee millimeter van de bodem van het reservoir is, draai snel de regulator naar nul PSI om de stroom te stoppen. Het is belangrijk om de luchtstroom te stoppen voordat het reservoir leeg is, anders kan het monster uit het opvangreservoir worden geëjecteerd. Verzamel vervolgens de behandelde cellen uit het uitstroomreservoir en plaats ze in een microcentrifugebuis.
Bij kamertemperatuur zullen de behandelde cellen materiaal blijven opnemen tot maximaal 10 minuten. Na 10 minuten, plateer de cellen met extra media of ga door met het gebruik van de cellen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor vectorvrije aflevering van macromoleculen in doelcellen via snelle mechanische deformatie. Het protocol beschrijft het gebruik van een microfluidisch apparaat om dit proces te faciliteren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Celbiologie
- Microvloeistoftechniek
- Intracellulaire afleveringstechnieken
Achtergrond
- Mechanische disruptie biedt een nieuwe benadering voor het afleveren van materialen in cellen.
- Deze methode kan zich richten op uitdagende celtypen die moeilijk te transfecteren zijn.
- Het heeft potentiële toepassingen in de cancertherapie en de manipulatie van immuuncellen.
- Flowcytometrie wordt gebruikt om de effectiviteit van de aflevering te beoordelen.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor efficiënte intracellulaire aflevering van macromoleculen.
- Om het begrip van celherprogrammeringstechnieken te verbeteren.
- Om de therapeutische effectiviteit van immuuncellen tegen tumoren te verhogen.
Gebruikte methoden
- Fabricage en sterilisatie van een microfluïdisch apparaat.
- Bereiding van celstroomoplossingen en aflevermaterialen.
- Drukzetting van het microfluïdische apparaat om celdeformatie te induceren.
- Flowcytometrie-analyse om het succes van de aflevering te evalueren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle afgifte van macromoleculen in doelcellen is bereikt.
- Flowcytometrie bevestigde een effectieve intracellulaire opname.
- De methode vertoonde voordelen ten opzichte van traditionele afgifte-technieken.
- Potentiële toepassingen in de kankerbehandeling werden belicht.
Conclusies
- Deze mechanische afleveringsmethode is een veelbelovend alternatief voor uitdagende celtypen.
- Het opent nieuwe wegen voor onderzoek naar cellulaire manipulatie en therapie.
- Verdere studies zijn nodig om de techniek te optimaliseren voor diverse toepassingen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Vectorvrije intracellulaire aflevering blijft een kritieke bottleneck in de therapeutische ontwikkeling, met name voor primaire immuuncellen en moeilijk te transfecteren celtypen. Dit microfluïdische squeezing-platform maakt directe cytosolische aflevering van macromoleculen en nanomaterialen mogelijk zonder chemische modificatie of gespecialiseerde buffers, waardoor mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie wordt verminderd. Door de afleveringsefficiëntie in uitdagende systemen te verbeteren, ondersteunt deze methode het voorspellende vertrouwen in vroege discovery en vermindert ze de risico's in translationele trajecten voor toepassingen in immunotherapie en regeneratieve geneeskunde.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele ondervraging van therapeutische hypothesen in primaire immuuncellen en herprogrammeringsmodellen mogelijk.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar, buffer-vrij systeem voor het afleveren van transcriptiefactoren, antilichamen of nucleïnezuren om target-engagement te beoordelen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door de intracellulaire aflevering van effectormoleculen te bevestigen voorafgaand aan functionele assays.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, op flowcytometrie gebaseerde uitlezingen van de afleveringsefficiëntie over verschillende celtypen en materiaalconcentraties.
- Operationele waarde: Standaardiseert de monstervoorbereiding via gecontroleerde afschuifsnelheden en apparaatgeometrie, waardoor variabiliteit in high-throughput-screenings wordt geminimaliseerd.
- Assay-gereedheid: Levert percentages van de aflevering en levensvatbaarheidsmetrieken die het rangschikken van verbindingen of materialen in workflows voor lead-identificatie mogelijk maken.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen immuuncelmodulatie op ontdekkingsschaal en de preklinische evaluatie van verbeterde antitumorale effectiviteit.
- Mechanistische risicoreductie: Bevestigt de cytosolische afgifte van immunomodulerende eiwitten, waardoor de afhankelijkheid van endogene expressiesystemen wordt verminderd.
- Ziekterelevante systemen: Ondersteunt testen in primaire T-cellen, dendritische cellen en stamcellen die relevant zijn voor kankerimmunotherapie en regeneratieve geneeskunde.
Pipeline- & Workflowintegratie
De methode past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek, waardoor hypothesetesting in de vroege biologie, het genereren van assay-klare monsters voor screening en mechanistische validatie voorafgaand aan in vivo studies mogelijk worden.
- Discovery Biology: Faciliteert targetvalidatie door CRISPR-componenten, siRNAs of antilichamen af te leveren om de betrokkenheid van signaalpaden bij immuunactivatie of het lot van de cel te bevestigen.
- Screening: Levert bibliotheken van nanomaterialen of peptiden af aan immuuncellen voor opname en functionele screening onder gestandaardiseerde afschuifcondities.
- Analytics: Biedt via flowcytometrie afgeleide afleveringsificiëntie en levensvatbaarheidspercentages als kwantitatieve eindpunten voor de vergelijking van condities.
- Translationeel Onderzoek: Maakt preklinische tests van gemanipuleerde immuuncellen met afgeleverde payloads mogelijk om de tumor-dodende activiteit in co-cultuurmodellen te beoordelen.
- Enterprise Hergebruik: Het platformontwerp maakt hergebruik over verschillende celtypen en payloads mogelijk met enkel optimalisatie van druk en chip, wat schaalbare implementatie in discovery en procesontwikkeling ondersteunt.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert het aantal fout-negatieven bij target-validatie door aflevering te bewerkstelligen in primaire en niet-delende cellen waarin virale of lipidengebaseerde methoden falen.
- Operationele waarde: Elimineert de noodzaak voor payload-conjugatie, gespecialiseerde buffers of virale productie, waardoor de workflow wordt vereenvoudigd en de kosten per conditie worden verlaagd.
- Strategische waarde: Verhoogt het vertrouwen in immunomodulerende kandidaten in een vroeg stadium door intracellulaire aflevering te bevestigen vóór resource-intensieve dierstudies.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van afleveringsafhankelijke biologics, zoals cytokine-engagers of transcriptiefactortherapieën, op basis van bereikbare cytosolische concentraties.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van microfluïdische apparaten, het bereiden van cel-suspensies en drukregeling om verstoppingen of overmatige shear-geïnduceerde celdood te voorkomen.
- Afhankelijk van toegang tot microfluïdische chips, drukregelaars, reservoirsystemen en flowcytometrie voor de uitlezing; compatibel met standaard workflows in een biosafety cabinet.
- Vereist standaardisatie van de celconcentratie (1–10 miljoen/mL), voorafgaand filtreren via 40 µm filters en incubatietijd (≤10 min na aflevering) voor reproduceerbaarheid tussen gebruikers en locaties.
- Vereist optimalisatie van de druk (bijv. 70 PSI) en stroomsnelheid per celtype en chipontwerp om de balans tussen afleveringsefficiëntie en viabiliteit te bewaken, waarbij het verlies aan viabiliteit onder geoptimaliseerde omstandigheden doorgaans <20% is.
- Beperkt door mogelijke verstoppingen door aggregaten of debris, waardoor celstraining en regelmatige vervanging van de chip noodzakelijk zijn; de prestaties variëren afhankelijk van de celgrootte, membraanstijfheid en het molecuulgewicht van de lading.
