Monitoring Equilibrium veranderingen in RNA structuur door 'Peroxidative' en 'Oxidatieve' hydroxyl radicaal Footprinting

Het algemene doel van het volgende experiment is om vast te stellen hoe RNA-moleculen vouwen met behulp van hydroxylradicaal-footprinting. Dit wordt bereikt door eindlabeling, gelzuivering en voorafvouwen van het RNA, wat de conformationele integriteit van het RNA waarborgt voorafgaand aan de magnesium-gemedieerde vouwing; in een volgende stap worden de Fenton-reagentia gemengd om hydroxylradicalen te genereren, die vervolgens de RNA-backbone kunnen splitsen op basis van de toegankelijkheid voor het oplosmiddel. Vervolgens worden de RNA-splitsingsproducten gescheiden door denaturerende polyacrylamidegelelektroforese en gevisualiseerd via autoradiografie.

De bandintegralen worden gekwantificeerd met semi-geautomatiseerde software voor footprinting-analyse. Het uiteindelijke doel is om vouwingsisothermen te genereren die de vorming van de tertiaire structuur van RNA weerspiegelen. Dit wordt bereikt door de genormaliseerde bandintegralen om te rekenen naar fractionele verzadiging.

De isothermen kunnen vervolgens worden gefit aan de Hill-vergelijking. Het belangrijkste voordeel van hydroxy-footprinting is dat men informatie over de tertiaire structuur van RNA verkrijgt met behulp van goedkope chemicaliën; vanwege de hogere activiteit bij een kleine omvang zijn hydroxyradicalen uitstekende probes om onderscheid te maken tussen solvent-toegankelijke en begraven nucleotiden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van de RNA-structurele biologie.

Hoe gebruiken ribosomen bijvoorbeeld metaalionen om hun actieve conformatie te bereiken? Hydroxyradicaal-footprinting kan worden gebruikt om de fundamenten van RNA-specificiteit en -herkenning te begrijpen. Naast het onthullen van informatie over de tertiaire structuur van RNA, kan deze methode worden gebruikt om de precieze eiwitbindingsplaatsen in RNA- of DNA-moleculen te bepalen.

De belangrijkste uitdagingen van deze methode zijn het voorkomen van monsterdegradatie door ribonuclease en het optimaliseren van de ijzerconcentratie om de juiste hoeveelheid RNA-splitsing te verkrijgen. Daarnaast kan de gedetailleerde analyse van de bandintervallen vrij complex zijn. Het hoofddoel van deze video is om de kijker te helpen bij het begrijpen van de planningsfasen en de succesvolle uitvoering van het hydroxylradicaal-footprintingexperiment. Bereid vóór de start van dit protocol alle footprinting-reagentia voor zoals beschreven in het schriftelijke protocol.

Samen met deze video kan RNA worden geproduceerd met DFO's, vier verwante en uiteinde-gelabelde sequenties, zoals daar beschreven. Zuiver het radioactief gelabelde RNA met behulp van denaturerende gelelektroforese. Win het gezuiverde RNA terug via twee opeenvolgende gelextracties met 0,3 molair natriumacetaat.

Precipiteer vervolgens het RNA door 0,5 milliliters van de waterige oplossing te mengen met één milliliter ethanol. Incubeer het mengsel gedurende één minuut op droogijs. Gooi na het centrifugeren van de sample de supernatant weg. Was de RNA-pellet met 70% ethanol.

Verwijder het supernatant na aanvullende centrifugatie en droog het pellet in een vacuüm. Los vervolgens de gezuiverde P 32 gelabelde RNA-monsters op. Pipetteer 30 µL van de RNA-oplossing in een nieuwe reactiebuis met 330 µL van een één maal reactiebuffer.

Precipiteer het RNA met ethanol en droog vervolgens de pellet in een vacuüm. Zodra deze gedroogd is, kan de pellet worden gebruikt voor het genereren van de referentieladder zoals beschreven in de schriftelijke procedure. Denatureer de resterende gebufferde RNA-oplossing door deze twee minuten te verhitten bij 95 °C. Laat de monsters 15 minuten afkoelen tot kamertemperatuur en volg dit met een korte centrifugatie (quick spin) om het condensaat weer in oplossing te brengen. Om te beginnen met het footprint-experiment, bereid 27 reactiebuisjes voor, voldoende monsters om een elektroforesegel van 30 putjes te vullen.

Nadat de ladders en de gesplitste controle zijn toegevoegd, bepaalt u de uiteindelijke magnesiumionconcentraties, zodat deze gelijkmatig verdeeld zijn op een logaritmische schaal over verschillende grootteordes rond het middelpunt van de titratie; de bereiding van de magnesiumionen in één keer reactiebuffer wordt apart in de tekst beschreven. Incubeer het RNA en de magnesiumionoplossingen vijf minuten bij 50 °C. Meng vervolgens 10 µL van de RNA-oplossing met 90 µL van de overeenkomstige hoeveelheid magnesiumionoplossing.

Om een eindvolume van 100 µL te bereiken, wordt elk mengsel 30 minuten geïncubeerd bij 50 °C. Laat de oplossingen vervolgens gedurende één uur equilibreren bij 25 °C, terwijl de RNA-vouwing plaatsvindt. Bereid ondertussen, direct vóór het starten van de hydroxylradicaal-footprintingreactie, het fantoomreactiemengsel voor zoals beschreven in het schriftelijke protocol.

Bereid de peroxidatiereactie voor door druppels van telkens 2 µL ijzer-EDTA, natriumascorbaat en waterstofperoxide bovenin de reactiebuis met de RNA-oplossing te pipetteren, zodanig dat de druppels elkaar niet raken. Start de footprintingreactie door krachtig te mengen. Stop de reactie na 15 seconden door 300 µL pure koude ethanol toe te voegen.

Draai de buisjes drie tot vijf keer. Precipiteer, was en droog tenslotte het pellet zoals eerder uitgevoerd. Als alternatief voor de peroxidatieve reactie kan de oxidatieve hydroxylreactie worden uitgevoerd door vijf µL van de vers bereide Fenton-reactiemix aan de monsters toe te voegen. Incubeer de oxidatieve reactie 30 minuten bij 25 °C.

Voeg vervolgens 300 µL pure koude ethanol toe om de reactie te stoppen en meng door de buisjes te draaien. Precipiteer opnieuw. Was en droog het pellet na voltooiing van zowel de peroxidatieve als de oxidatieve reactie.

Los de gedroogde RNA-pellets op in acht µL van gel-laadkleurstof twee. Bevestig met een geigerteller dat het P 32-gelabelde RNA is geresuspendeerd. Bereid een denaturerende 8% polyacrylamide sequencinggel voor volgens standaardprotocollen. Laad de monsters, inclusief twee referenties en een gesplitste controle, met behulp van een kam met 30 putjes.

Scheid de RNA-fragmenten gedurende twee en een half uur bij 60 tot 75 watt. Stel de gedroogde gel gedurende de nacht bloot aan een fosfor scherm voor opslag. Scan het fosfor scherm met een imaging-systeem voor filmloze autoradiografie.

Zet vervolgens het gelafbeeldingsbestand over naar de computer voor analyse. Om de gegevensanalyse te starten, opent u Safa en open-source software voor single band fitting en kwantificatie. Laad de RNA-sequentie als een .TXT-bestand, gevolgd door de gelafbeelding als een .gel-bestand.

Definieer de banen en pas de bandintensiteiten aan. Kies vervolgens een ankerbaan en voer een geluitlijning uit waarbij banden worden toegewezen aan nucleotiden in relatie tot de RNA's T one digestieladder. Kwantificeer de bandintensiteiten en gebruik de normalisatie/kleurplot-functie om te normaliseren en potentieel invariante residuen toe te wijzen.

Sla de output op als een txt-bestand. SFA genereert een spreadsheet met kolommen die de banen op de gel vertegenwoordigen en rijen die de individuele bandintegralen van het RNA-fragment vertegenwoordigen. Ten eerste moeten de beschermingsplaatsen die een merkbare verandering in oplosmiddeltoegankelijkheid vertonen worden geïdentificeerd door het beschermingsprofiel van de monster zonder magnesiumionen te vergelijken met het profiel van de eindconcentratie magnesiumionen.

Hoe lager de waarde, hoe beter het nucleotide is beschermd tegen aanval door hydroxylradicalen en vice versa. Maak vervolgens transitiecurven van bandintensiteiten van individuele nucleotiden of groepen nucleotiden tegenover de magnesium-ijzerconcentratie met behulp van een spreadsheetformaat; schaal deze transities individueel naar de fractionele verzadigingsfunctie zoals beschreven in het tekstgedeelte van dit protocol. Pas als laatste stap de gegevens aan op de Hill-vergelijking.

Deze analyse schaalt de overgang naar fractionele verzadiging, bepaalt het middenpunt van de overgang en biedt een fenomenologische test om vast te stellen of een getoonde overgang sigmoïdaal is. Hier zijn representatieve resultaten van hydroxylradicaal-footprintingexperimenten met P four P six RRNA. Isothermen zijn afgeleid van sequencinggels die door Safa zijn geanalyseerd en vervolgens zijn gefit zoals beschreven in het analysegedeelte.

De gelafbeelding geeft aan dat de achtergrondsplitsing minimaal is en dat toewijzing van enkelvoudige nucleotiden mogelijk is dankzij goed gedefinieerde banden in de T-baan. De door hydroxylradicalen geïnduceerde fragmentatie van RNA ligt ruim boven de achtergrond. De overgang van lage naar hoge magnesiumionconcentraties is selectief geassocieerd met een afnemende intensiteit van individuele banden en groepen banden, wat duidt op de vorming van RNA.

Bescherming van de tertiaire structuur verwijst naar enkele of groepen aaneengesloten nucleotiden waarvan de splitsing gelijktijdig veranderingen in bandintensiteiten teweegbrengt; deze worden gekwantificeerd en genormaliseerd via saffer-analyse. De output is een thermisch diagram dat de mate van bescherming tegen hydroxylradicalen visualiseert. De kleurovergang beschrijft de verandering in toegankelijkheid na toevoeging van magnesium-ijzer: wit naar rood duidt op meer toegankelijke nucleotiden, terwijl wit naar blauw duidt op meer beschermde nucleotiden.

Elke graad van schaduwvorming is gekoppeld aan een numerieke waarde, die kan worden uitgezet als een beschermingscurve en geanalyseerd kan worden met een bindingsmodel zoals de Hill-vergelijking. In dit voorbeeld is de evenwichtsdissociatieconstante die geassocieerd is met protectie 1 5 3 tot 1 5 5 ongeveer twee keer zo groot als de overeenkomstige waarde van protectie 1 6 3 tot 1 6 4. Dit experiment voor hydroxylradicaal-footprinting kan in anderhalve dag worden voltooid indien dit correct wordt uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om handschoenen en een laboratoriumjas te dragen om RNA-contaminatie te voorkomen. Daarnaast hangt de uiteindelijke ijzerconcentratie af van het experimentele systeem. Daarom raden we aan om een dosis-responsexperiment uit te voeren voordat u overgaat tot footprinting volgens deze procedure.

Andere methoden, zoals tijdsongeloopte hydroxyradicaal-footprinting, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden. Bijvoorbeeld: op welk kritiek tijdstip bereiken RNA-moleculen na hun ontwikkeling een misgevouwen of actieve conformatie? Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de structurele biologie om zowel inter- als interim-tertiaire moleculaire interacties van nucleïnezuren te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de vorming van de tertiaire structuur van RNA-moleculen kunt bepalen. Houd er rekening mee dat er bij bepaalde stappen gevaarlijke stoffen worden gebruikt; voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen en een veiligheidsbril, alsook het gebruik van een plexiglas scherm, worden aanbevolen tijdens het uitvoeren van deze procedure.