Eiwit Membraan Overlay Test: een protocol om interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten Test In vitro

Eiwittesten. Protein-interactie is onmisbaar voor de dissectie van de eiwitfunctionaliteit. Deze video introduceert een in vitro eiwit-eiwitbindingsassay om de interactie tussen een membraangebonden en geïmmobiliseerd eiwit met een oplosbaar eiwit te testen.

Eerst worden fusie-eiwitten gekloond, tot expressie gebracht en geëxtraheerd. Het gelabelde onoplosbare eiwit wordt geïmmobiliseerd op een nitrocellulosemembraan en behandeld om het terug te vouwen naar zijn natuurlijke conformatie. Vervolgens wordt het membraan gesondeerd met gelabelde oplosbare eiwitten en wordt er immunoblotting uitgevoerd om de eiwitten te detecteren.

Indien de getagde eiwitten interageren, worden ze gevangen door het eiwit dat op het membraan is geïmmobiliseerd, en zal het signaal van de immunoblotting worden waargenomen. Deze assay biedt dus een betrouwbare methode om de interactie tussen een onoplosbaar eiwit en een eiwit in oplossing te testen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals de GST pull-down, is dat u de binding tussen onoplosbare eiwitten en oplosbare eiwitten in vitro betrouwbaar kunt beoordelen.

De eerste stap van deze procedure is het genereren van genetisch gelabelde eiwitten voor detectie. Begin met het kloneren van het eiwit dat op het membraan geïmmobiliseerd zal worden. Dit wordt aangeduid als pro Im voor geïmmobiliseerd eiwit in een expressievector die codeert voor een grote tag zoals GST; de lege expressievector, die alleen voor de tag codeert, wordt gebruikt als negatieve controle voor het geïmmobiliseerde eiwit en wordt aangeduid als pro IM nc.

Kloon vervolgens het eiwit dat als oplosbare probe zal worden gebruikt in een expressievector, coderend voor een andere tag, zoals strep two. Dit zal worden aangeduid als prosol voor oplosbaar eiwit; kloon een negatieve controle van een oplosbaar eiwit in dezelfde expressievector. Dit zal worden aangeduid als Prosol NC voor oplosbaar eiwit negatieve controle.

Gebruik vervolgens een eiwitexpressiesysteem, zoals een coli- of balo-virus, om de getagde eiwitten tot expressie te brengen. Het gebruikte expressiesysteem moet zorgvuldig worden gekozen op basis van de vereisten voor posttranslationele modificaties. Extraheer de tot expressie gebrachte eiwitten uit het gekozen organisme. Voor pro IM en pro I mnc Resus.

Resuspendeer de cellen in SDS-page-laadbuffer met een protease-remmingscocktail. Kook de cellen vervolgens vijf minuten en centrifugeer ze daarna om het precipitaat te verwijderen voor de extractie van Prosol en prosol NC. Gebruik hiervoor standaardprocedures. De pro IMS kan onder denaturerende omstandigheden worden geëxtraheerd, aangezien de eiwitten opnieuw zullen vouwen nadat ze zijn geïmmobiliseerd in het nitrocellulosemembraan.

Prosol moet echter worden geëxtraheerd om een native bevestiging te verkrijgen, omdat deze aan de bindingsbuffer worden toegevoegd zodra de getagde eiwitten zijn geëxtraheerd. Bepaal de concentratie van de recombinante eiwitten met een standaardmethode, zoals de BioRad protein assay kit. Indien er ruw extract in plaats van gezuiverd eiwit voor de assay zal worden gebruikt.

Schat de concentratie van het eiwit van belang via scannende densitometrie van de corresponderende band op een met kumasi gekleurde SDS-polyacrylamidegel, gebruikmakend van bekende concentraties BSA als referentie. Zet vervolgens de standaardcurve uit op basis van de signaalintensiteiten die zijn gemeten met de scannende densitometrie van de BSA en bereken de hoeveelheid eiwit in het ruwe extract.

De volgende stap van de procedure is het immobiliseren van pro Iam en pro IAM NC op het membraan. Begin met het laden van telkens één microgram pro Iam- en pro IAM NC-extracten in dubbeltoets op een SDS-polyacrylamidegel. Verwijder na elektroforese de gel uit de glasplaten en plaats deze in 100 milliliters transferbuffer, waarna deze gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur wordt geïncubeerd onder zachte agitatie.

Voer na de incubatie een western blot uit om de eiwitten over te brengen op een nitrocellulosemembraan; laat na de transfer de aan het membraan gebonden eiwitten hervouwen. Plaats het membraan in 15 milliliters buffer A en incubeer dit onder zachte agitatie. Om residu SDS te verwijderen, wordt er gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd onder zachte agitatie.

Verwijder na de incubatie voorzichtig het membraan uit de buffer. Plaats het membraan vervolgens in 25 milliliters denaturatiebuffer. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur onder zachte agitatie.

Tijdens de incubatie wordt het nitrocellulosemembraan opaak. Breng het membraan vervolgens met een pincet over naar 25 milliliters TBS en incubeer dit gedurende vijf minuten onder zachte agitatie. Tijdens deze stap keert het membraan terug naar zijn oorspronkelijke witte kleur.

Breng vervolgens het membraan over naar 25 milliliters bindingsbuffer. Incubeer gedurende de nacht bij vier graden Celsius onder zachte agitatie. Vervolgens wordt het oplosbare eiwit gebruikt om het membraan te sonderen op het geïmmobiliseerde eiwit.

Bereid eerst de hybridisatiebuffers voor door 1 tot 10 µg prosol en prosol NC te verdunnen in afzonderlijke buisjes met 10 mL verse bindingsbuffer. Breng de buffer vervolgens over naar een hybridisatiezak. Knip daarna het membraan in twee stroken, die beide pro IM en pro IAM nc bevatten.

Deze membranen worden in de hybridisatiebuffer geplaatst. Breng elk membraan over naar de prosol- of prosol NC-hybridisatieoplossing en incubeer deze gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur onder lichte agitatie. Verwijder de membranen uit de hybridisatieoplossingen en spoel deze drie keer gedurende 15 minuten met TBS.

Om eiwit-eiwitinteracties te visualiseren, wordt het membraan gedurende één uur geblokkeerd met 2,5% magere melk in TBST. Na de incubatie worden de geblokkeerde membranen geplaatst in de primaire antilichaamoplossing. Hierbij wordt antis strep two polyklonaal konijnenantilichaam gebruikt.

Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur met zachte agitatie na de incubatie. Spoel de membranen gedurende 15 minuten in 20 milliliter TBST en tweemaal gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met zachte agitatie. Plaats de membranen vervolgens in de HRP-geconjugeerde secundaire antilichaamoplossing. Hierbij wordt een anti-konijn IgG-antilichaam gebruikt dat geconjugeerd is aan HRP.

Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur onder zachte agitatie. Spoel de membranen 15 minuten lang in 20 milliliters TBST en daarna twee keer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur onder zachte agitatie zoals voorheen; na de laatste spoeling in TBS wordt de proteïne-proteïne interactie gevisualiseerd met behulp van een HRP-chemiluminescent substraat van Millipore (Molan Western Chemiluminescent).

HRP-substraat wordt gebruikt na immunoblottings van het prosol. Spoel het membraan met TBST gedurende 15 minuten en tweemaal gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Probeer de membranen vervolgens opnieuw met het primaire antilichaam tegen de tag van pro.

Vervolgens wordt het geschikte secundaire antilichaam toegevoegd. Visualiseer PRO I en pro Im NNC door chemiluminescentie te detecteren om de identiteit van de banden verkregen in de proteïne-membraan overlay-assay te valideren. De interactie tussen de proteïnen A en K en YFP en MP CYFP werd beoordeeld in epidermale cellen van tabak met behulp van de methode zoals beschreven in deze video, zoals hier getoond.

Toen biomoleculaire fluorescentiecomplementatie werd beoordeeld, werd een sterk YFP-signaal gereconstrueerd. Dit BFC-signaal hoopte zich op in Punta aan de celperiferie, wat diagnostisch is voor het plasmamembraan omdat MP een zeer onoplosbaar eiwit is. Bij expressie in bacteriën of planten werd de protein membrane overlay assay toegepast om deze interactie te valideren.

In vitro proteïne-extracten die één µg GST MP of niet-gefuseerde GST bevatten, werden gescheiden door SDS-polyacrylamidegelelektroforese, gevolgd door elektrotransfer naar een nitrocellulosemembraan. Wanneer deze membranen werden gesondeerd met oplosbare a nnk strep two, vertoonde GST mp binding, maar niet de niet-gefuseerde GST. Bovendien werd er geen binding waargenomen wanneer dezelfde set membranen werd gesondeerd met een niet-gerelateerd pro saw nc IE Arabidopsis cytoplasmatische NADH-kinase getagd met strep two, wat de specificiteit van de A NK MP-interactie verder aantoont. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de geïmmobiliseerde proteïnen correct aan te vullen volgens het gepresenteerde protocol.