Imaging Feromoon Sensing in een muis Vomeronasal Acute Tissue Slice Voorbereiding

Het algemene doel van deze procedure is het maken van een acute weefselsnijpreparaat van het RO-neusorgaan of VNO van de muis, om calcium-imagingexperimenten uit te voeren op subpopulaties en/of individuele neuronen in levend weefsel. Dit wordt bereikt door eerst het VNO uit de neus van de muis te extraheren en dit vervolgens onder een dissectiemicroscoop in koud A CSF uit de kraakbeencapsule te micro-dissecteren. Daarna wordt het geïsoleerde VNO verticaal in een agarblok geplaatst en worden er met een microtoom acute coronale weefselsneden gemaakt om de integriteit van het weefsel te verifiëren.

Enkele coupes worden na immunohistochemie geobserveerd onder een confocale microscoop. Andere coupes worden geladen met een calciumsensitieve kleurstof en vervolgens geperfundeerd met vermeende feromoonliganden, waarna neuronale activatie wordt geobserveerd met behulp van calcium imaging. Deze methode kan helpen bij het oplossen van cruciale vraagstukken binnen het olfactory-veld.

Honderden feromonereceptoren worden bijvoorbeeld tot expressie gebracht in het romo-neusorgaan, maar voor slechts enkele hiervan zijn liganden geïdentificeerd. Feromonereceptoren zijn zeer moeilijk tot expressie te brengen in een heteroloog systeem. We moesten een efficiënte in vivo-assay ontwikkelen om specifieke feromonen aan specifieke receptoren toe te wijzen.

We kunnen transgenicen muizen gebruiken waarbij een specifieke subpopulatie neuronen onbekende receptoren tot expressie brengt en kan worden geïdentificeerd door de expressie van GFP. We zouden deze assay ook kunnen gebruiken om ionkanalen en enzymen die betrokken zijn bij de Fairmont-transductiecascade farmacologisch te onderzoeken en zo de procedure te demonstreren. Vandaag worden Julian en Fabian, twee onderzoekers uit mijn laboratorium, de dissectie uitgevoerd.

Bereid vers, koud, kunstmatig cerebrospinaal vocht, A CSF verzadigd met oxy carb door alle ingrediënten te combineren, behalve het calciumchloride. Verzadig de oplossing door er direct oxy carb doorheen te borrelen. Voeg vervolgens het calciumchloride toe en vul aan met dubbel gedestilleerd water tot het gewenste volume.

Houd de A CSF-oplossing op ijs tot gebruik. Na euthanasie en decapitatie van een volwassen muis, bereidt u een Petrischaal met koude en continu gezuursstof- en koolzuurverzadigde A CSF voor. Plaats na het verwijderen van de onderkaak de kop van de muis in de Petrischaal.

Positioneer de kop van de muis onder de dissectiemicroscoop om het gehemelte te kunnen visualiseren. Maak vervolgens met microscharen een horizontale incisie in het bovenste gedeelte van het gehemelte en verwijder daarna het gehemeltemembraan met micro-dissectiepincetten. Hydrateer en reinig de blootgelegde holte met A CSF.

Snijd het bovenste en onderste deel van het neustussenschot door. Extraheer vervolgens voorzichtig het neustussenschot met het VNO en plaats dit verticaal in schoon A CSF. Scheid de twee delen van het VNO met behulp van micro-dissectiepincetten.

Identificeer het kraakbeencapsule van het VNO en verwijder dit vervolgens voorzichtig, waarbij u ervoor zorgt dat alle kraakbeendelen worden verwijderd. Het geïsoleerde VNO, de kraakbeendelen en het niet-gedissecteerde VNO worden hier aangegeven. Bereid vervolgens 3% laagsmeltende agarose voor en richt de werkruimte in met de benodigde instrumenten. Vul de inbedmal met agarose en zorg ervoor dat de temperatuur lager is dan 41 °C voordat u het gedissecteerde VNO onderdompelt. Positioneer het weefsel verticaal om coronale coupes te verkrijgen.

Plaats de inbedmal één minuut op ijs tot de agar stolt. Verwijder na één minuut het agarblok, snijd de agar in een parametale vorm en plak deze vervolgens aan de houder van de microtoom. Maak coronale VNO-coupes met de microtoom bij een snelheid van 0,5 millimeter per seconde, een amplitude van 0,7 millimeter en een dikte van 100 micrometers in koud CSF.

Verzamel de weefselcoupes met een penseel en plaats deze in een weefselkweekplaat gevuld met koude A CSF om te verifiëren of de structurele integriteit van de verzamelde weefselcoupes behouden is; deze kunnen vervolgens worden gefixeerd en immunogekleurd voor cytoskeletcomponenten of andere eiwitten van belang. Hier demonstreert immunokleuring tegen geacetyleerd tubuline in paars de structurele integriteit van de weefselcoupe. Bovendien toont de observatie van een specifieke neuronale populatie, waarbij een bepaalde feromoonreceptor is gelabeld met GFP, de behouden neuronale morfologie: neuronen met kleine ovale cellichamen en lange dendrieten die het oppervlak van het lumen bereiken en eindigen met microvilli kunnen worden waargenomen bij arbeid in een donkere kamer.

Incubeer de VNO-coupes gedurende één uur bij 37 °C in een laadoplossing van koude A CSF met zeven micromolair URA 2:00 AM en 0,1% onic. Bewaar de geladen coupes op ijs met oxy carbonatie tot gebruik. Gebruik een penseel om de geladen coupes in een perfusiekamer met A CSF te plaatsen en zet de coupes vast met een weefselcoupe-anker.

Plaats de perfusiekamer op de microscooplid van een opstelling voor calcium-imaging en perfuseer continu met zuurstofrijke, gecarboneerde A CSF bij kamertemperatuur. Observeer de geladen VNO-plakken met behulp van de fluorescentiegolflengten die overeenkomen met de kleurstof, wat 340 tot 380 nanometer is voor Fura-2 AM. Gebruik de geschikte software om veranderingen in de intracellulaire calciumratio te registreren. Een perfusiesysteem is noodzakelijk om chemische stimulatie op te wekken.

Hier is een coronale doorsnede van vno-weefsel van een muis waarbij de subpopulatie neuronen die de V one RB two pheromoonreceptor tot expressie brengt ook GFP tot expressie brengt, immunogekleurd tegen het geacetyleerde tubuline-eiwit, weergegeven in paars. Vergrotingen van de doorsnede tonen het behoud van de weefselintegriteit. Neuronen met lange dendrieten zijn te zien die het oppervlak van het lumen bereiken, en de expressie van het structurele eiwit is zichtbaar in de dendritische knoppen en microvilli voor calcium-imaging.

FU-geladen weefselsneden worden eerst gevisualiseerd met behulp van Hoffman-fasecontrast om het gebied van interesse te lokaliseren; beginnend bij het bloedvat (de eerste witte pijl), beweegt de waarnemer langzaam richting het lumen (de tweede witte pijl) en de neuro-epitheliale regio. Het ovale cellichaam van het RO-nasale neuron (de derde witte pijl) kan worden geïdentificeerd aan zijn lange en dunne dendriet.

De vierde witte pijl wijst naar het lumen, de neuronale dendritische knop. De vijfde witte pijl geeft microvilli aan in contact met feromoon-RA-geladen cellen; hier getoond bij 80 nanometer, waarna ze sequentieel worden belicht bij 40 en 80 nanometer, en deze fluorescente golflengteverhouding is correlerend met de intracellulaire calciumveranderingen in de geselecteerde neuronen, aangegeven met zwarte, rode en blauwe cirkels. Een TP wordt gebruikt om de levensvatbaarheid van de neuronen te bepalen.

Let op de variatie in calciumresponsen die wordt vertoond over de drie geselecteerde neuronen en het feit dat neuron nummer twee (rode cirkel) niet reageert op een TP en daarom zal worden weggelaten uit verdere analyses. Chemische stimulatie wordt vervolgens bereikt met behulp van zowel urine als een mengsel van muisferomonen, waarbij in de diepte van de weefselcoupe wordt gekeken. Een subpopulatie neuronen die zowel GFP als de V1RRB2-receptor tot expressie brengt, kan worden gelokaliseerd.

Hier wordt een neuron dat zowel GFP als de V1RB2-receptor tot expressie brengt, getoond naast een neuron dat geen V1RB2 tot expressie brengt. Beide cellen zijn geladen met URA 2:00 AM en het V1RB2-exprimerende neuron vertoont een calciumpiek als reactie op perfusie van de ligand van de receptor, 2-heptenool. Opvallend is dat het niet-V1RB2-exprimerende neuron ook reageert op 2-heptenool, wat de complexiteit van de pheromooncodering in het VNO demonstreert.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u de muis kunt extraheren en microdissecteren voor het mar-celorgaan om acute weefselsnijden voor te bereiden. Dit protocol is ook aanpasbaar voor fysiologisch onderzoek met behulp van alternatieve calciumkleurstoffen en microscoopopstellingen. Veel succes met uw experiment.