Vaste-fase-Submonomer Synthese van peptoïde polymeren en hun zelf-assemblage in zeer geordende nanosheets

Het algemene doel van deze procedure is het beschrijven van een eenvoudige en efficiënte methode voor peptide-synthese in vaste fase en de waterige zelfassemblage van peptiden tot hooggeordende nanovellen. Peptiden zijn structureel vergelijkbaar met polypeptiden en zijn gesubstitueerde glycine-polymeren waarbij de zijketens aan de stikstof in plaats van aan de alfa-koolstof zijn gebonden. Het proces begint met de synthese van een specifieke peptidevolgorde via de sub-monomeermethode.

De sub-monomeermethode bestaat uit twee eenvoudige chemische stappen waarbij elk monomeer sequentieel in de keten wordt ingebouwd. Ten eerste wordt een amine dat aan een vaste drager is gebonden, bromogeacetyleerd. Ten tweede wordt het bromide vervangen door een primair amine.

Deze stappen worden herhaald totdat de gewenste ketenlengte is bereikt. Na de ketenverlenging wordt het peptide van de vaste drager gesplitst en wordt de resulterende ruwe peptide-olie gezuiverd via HPLC en gekarakteriseerd om de zelfassemblage van peptiden tot nanovellen te initiëren. Een verdunde waterige bufferoplossing van het peptide wordt bereid in een glazen vial en voorzichtig gemengd. Als laatste stap.

De nanovellen worden onder de microscoop onderzocht. De resultaten tonen aan dat een iteratieve cyclus van twee eenvoudige chemische stappen een sequentie-specifiek polymeer kan opleveren dat spontaan zelf assembleert tot nanovellen. Peptiden vormen een nieuwe klasse bio-geïnspireerde polymeren met eigenschappen die tussen die van eiwitten en traditionele polymeren in liggen.

Ze zijn robuust en synthetisch veelzijdig zoals traditionele polymeren, maar zijn ook zeer instelbaar en sequentiespecifiek zoals eiwitten en DNA. Peptiden komen op als een geavanceerd materiaal om cruciale problemen in de biomedische wetenschap en materiaalkunde aan te pakken, zoals de identificatie van bioactieve geneesmiddelen of het ontwerp van kunstmatige eiwitten. De belangrijkste voordelen van peptiden zijn de nauwkeurige sequentiecontrole, de beschikbaarheid van ongelooflijk diverse bouwstenen, efficiënte synthese en protease-stabiliteit. De algemene methode voor handmatige peptidesynthese, waarbij gebruik wordt gemaakt van basisapparatuur en commercieel beschikbare reagentia, wordt beschreven, waardoor peptiden in de meeste laboratoria eenvoudig gesynthetiseerd kunnen worden.

Een visuele demonstratie van de synthetische stappen is essentieel en dient als een waardevol referentiekader voor personen die beginnen in het veld van vaste-fase-synthese. Hier worden voor het eerst de zuivering en karakterisering van een amfifiel peptide van 36 meren beschreven, evenals de zelfassemblage ervan tot hooggeordende nanoplaten. Begin dit protocol met het opstellen van de experimentele opstelling zoals beschreven in het geschreven protocol.

De volgende stappen worden voor de duidelijkheid uitgevoerd in een glazen reactievat in plaats van in een wegwerpcartridge van polypropyleen met een fritte bodem. Nadat 100 milligram R-amidehars in een reactievat met fritte bodem is geplaatst, wordt de hars gezwollen door twee milliliter dimethylformamide of DMF toe te voegen; agiteer gedurende 10 minuten door middel van bubbling. Laat de oplossing vervolgens via vacuüm aflopen om de gezwollen hars te isoleren.

Voeg vervolgens één milliliter 20% full methyl pyridine in DMF toe om de FM O-groep te deprotecteren. Agiteer gedurende twee minuten en laat het mengsel weglopen. Herhaal dit proces gedurende 12 minuten en spoel de hars vervolgens door twee milliliter DMF toe te voegen, 15 seconden te agiteren en het mengsel te laten weglopen.

Start met het opbouwen van de peptideketen met de eerste submonomeercyclus, die bestaat uit een bromoacetylering en een substitutiestap. Voeg voor de bromoacetylering 1 mL 0,6 M broomazijnzuur in DMF en 86 µL diisopropylcarbodiimide toe. Laat dit 30 minuten agiteren, laat het mengsel vervolgens aflopen en spoel na met 2 mL DMF.

Voer vervolgens de verdringing uit door één milliliter van één tot twee molair amine in end methyl pyro genone toe te voegen en 30 tot 120 minuten te incuberen. Giet na de incubatie af en spoel na met twee milliliters DMF. Ga vervolgens verder met het verlengen van de peptideketen door de submonomeercyclus te herhalen. Nadat de laatste verdringing is voltooid, spoelt u na met twee milliliters DMF.

Sluit dit af met een diora methaanwasdop en bewaar het reactievat tot aan de splitsing. Om met de splitsing te beginnen, brengt u alle gedroogde hars over in een scintillatieglasflesje van 20 milliliter; werk hierbij in een zuurkast en gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen. Voeg vier milliliter trifluorazijnzuur, of TFA-splitsingscocktail, toe aan het scintillatieglasflesje en sluit dit af. Roer krachtig gedurende 10 minuten tot twee uur bij kamertemperatuur.

Gebruik alternatief een rotatieruiter om de oplossing te mengen. Verzamel de TFA-splitsingsoplossing door de hars via een wegwerp-polypropyleen gefilterde cartridge te filteren in een nieuw, vooraf gewogen scintillatieglasbuisje van 20 milliliter. Voeg vervolgens één milliliter verse splitsingscocktail toe om de hars te spoelen en eventueel resterend peptide te verzamelen.

Herhaal dit en spoel tweemaal na. Verdampt de TFA door een zachte stroom stikstof te blazen of door gebruik te maken van een Biot Charge V 10-evaporator. Los de ruwe olie op in zes milliliter van een één-op-één mengsel van acetonitril en water.

Bevries en lyofiliseer vervolgens het monster. Dit proces moet nogmaals worden herhaald na de tweede lyofilisatie. Registreer het gewicht van het ruwe product en bewaar dit als een droog poeder bij -20 °C, waarbij de zuiverheid wordt gecontroleerd via een combinatie van analytische HPLC en/of electrospray LCMS.

De zuiverheid van het ruwe product en de aanwezigheid van het gewenste molecuulgewicht kunnen worden bepaald door de in de tekst beschreven procedures te volgen. Het ruwe peptidemengsel kan vervolgens worden gezuiverd met reverse phase prep HPLC volgens de beschreven procedure. Deze sectie beschrijft het protocol voor het vormen van vellen uit een enkele keten sequentie-specifiek amfifiel 36 me peptide.

Nadat de peptidestreng is gesynthetiseerd, gezuiverd en gelyofiliseerd, wordt het resulterende witte poeder opgelost in DMSO om een voorraadoplossing van twee millimolar te maken. Gebruik vervolgens een Dr.Glass-bestand om een peptideoplossing van 20 micromolar te bereiden. Voeg eerst 445 microliters milli Q-water en 50 microliters 10 x sheet formation buffer toe.

Vortex het vial om te mengen. Voeg vervolgens vijf µL van een 2 mM peptide-stockoplossing toe en laat dit voorzichtig zwellen. De resulterende oplossingsvellen worden gevormd door de zachte agitatie van de verdunde waterige peptide-oplossing.

Kantel het afgesloten glazen vials langzaam van de horizontale naar de rechtopstaande positie. Dit resulteert in het zacht schudden van de vellen, wat ook vellen oplevert. De vellen hebben echter de neiging kleiner te zijn en minder rechte randen te hebben voor veel hoogwaardige vellen.

Roteer de glazen vials gedurende één dag langzaam om de horizontale as met een buizenrotator of een aangepaste rocker voor fluorescentiekleuring van nanovelletjes; voeg 1 µL 100 µM Nile red toe aan 100 µL van de nanovelletjesoplossing om een eindconcentratie van 1 µM Nile red te verkrijgen. Nile red is een omgevingsgevoelige kleurstof waarvan de fluorescentie-intensiteit toeneemt wanneer deze gelokaliseerd is in hydrofobe omgevingen. Maak vervolgens een 1% aros-oplossing in heet water en giet deze in een plastic Petri-schaal.

Zorg ervoor dat de aros-oplossing ongeveer een achtste inch dik is en laat de oplossing ongestoord afkoelen op een vlak oppervlak. Nadat de aros is gestold, worden met een spatel vierkantjes van één centimeter bij één centimeter uitgesneden. Breng de uitgesneden vierkantjes vervolgens over naar een glazen objectglas om de vellen op hetzelfde vlak te verzamelen; pipetteer één microliter van de vloeistofoplossing op het stukje aros.

Na twee minuten zouden de aros de buffer moeten absorberen, waardoor de sheets aan het oppervlak achterblijven. Beeld de sheet binnen 15 minuten af. Alternatief, om sheets en oplossing af te beelden, brengt u 15 µL aan binnen een gasket van 20 millimeter diameter en 0,12 millimeter dikte op een glazen objectglas.

Dek het monster af met een dekglas en maak binnen enkele dagen beelden om SEM van de nanovellen uit te voeren. Ets eerst de siliciumchips met plasma om de absorptie van de nanovellen te bevorderen. Breng vervolgens 20 µL van de peptidsvel-oplossing aan op een plasma-behandelde siliciumsubstraat en laat de oplossing drie minuten inwerken; verwijder het overtollige volume met de punt van een Kimwipe, pipetteer 20 µL water op het oppervlak en zuig opnieuw het overtollige volume weg om buffer en zouten te verwijderen.

Als alternatief worden de peptidsheet-oplossingen gedialyseerd tegen water om buffer en zout te verwijderen. In dat geval kunnen 20 µL van de gedialyseerde sheet-oplossing op de plasmabehandelde siliciumsubstraten worden gedruppeld en aan de lucht worden gedroogd. Nadat de sheet-oplossing op de plasmabehandelde siliciumsubstraten is opgedroogd, kan de sheet met SEM worden afgebeeld met behulp van een in-lens detector bij bundelenergieën tussen 1 kV en 5 kV.

De synthese, karakterisering en zuivering van een sequentie-specifiek 36 me blok-geladen peptide, dat vouwt tot een zeer geordend tweedimensionaal nanovlak, is uitgevoerd. De amines die werden gebruikt voor de synthese van het 36 me blok-geladen peptide waren ethyleendiamine, fenethylamine en t-butyl-beta-alanine. Na de synthese werd het ruwe peptide van de hars gesplitst met 95% waterige TFA.

Nadat de TFA-oplossing was ingezameld en verdampt, werd het ruwe 36 me block charge peptide gezuiverd met reverse phase HPLC. De massa van het gezuiverde block charge peptide werd vervolgens bevestigd via MALDI.

De waargenomen massa van 4981,2 komt nauw overeen met de berekende massa van 4981,74. Het gelyofiliseerde poeder werd opgelost in DMSO om een stockoplossing van twee millimolar te maken en bewaard bij vier graden Celsius. De sheets werden bereid volgens het voornoemde protocol en afgebeeld met fluorescentie-optische microscopie.

Er worden diverse vormen waargenomen met kenmerkmatige afmetingen tot 300 microns, waarbij met name rechte randen prominent aanwezig zijn. SEM werd ook gebruikt om de vellen te beelden, wat op soortgelijke wijze prominente rechte randen onthulde. Deze video beschrijft een eenvoudig en efficiënt protocol voor de synthese van peptiden op een vast oppervlak en de waterige zelfassemblage van peptiden tot nanovellen.

Aangezien er letterlijk honderden am-gemiddelde bouwstenen gemakkelijk beschikbaar zijn en in dit protocol kunnen worden gebruikt, is de ontwerpruimte die toegankelijk is met polypeptiden vrijwel onbeperkt. Peptiden zijn veelbelovende materialen voor biomedisch en nanowetenschappelijk onderzoek vanwege hun synthetische flexibiliteit, robuustheid en ordening. Met name op atomair niveau dienen de nanolagen als een potentieel platform voor tweedimensionale display-steigers, membraanmimetica, biologische sensoren, eiwitmimetica en de fabricage van apparaten.

Werken met corrosieve reagentia zoals trior, azijnzuur en broomazijnzuur is uiterst gevaarlijk; om letsel te voorkomen, dienen alle reacties in een zuurkast te worden uitgevoerd en moet de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen worden gedragen.