Monitoring eiwitadsorptie met Solid-state Nanoporiën

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van nanoporiën in kunstmatige membranen voor gebruik in studies naar proteïneabsorptie. Dit wordt bereikt door nanoporiën in een nitridemembraan te boren met behulp van een stem. Vervolgens wordt de nanoporie in een kamer geladen en bevochtigd met een ionische oplossing.

Zodat de vloeistof een brug vormt van de ene kant van de nanopore naar de andere, om de nanopore klaar te maken voor experimenten. Er wordt een spanning over de nanopore aangelegd en er kan worden waargenomen dat er een ionenstroom doorheen loopt. De laatste stap is het toevoegen van proteïne aan de nanoporekamer.

Het uiteindelijke observeren van langdurige blokkades in de ionenstroom door de nanopore onthult de adsorptie van eiwitten aan de wanden van de nanopore. Hallo, ik ben Dave Wicki. Ik ben een promovendus bij de afdeling natuurkunde aan de Syracuse University.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de absorptie van eiwitten op anorganische oppervlakken, kan ze ook worden toegepast op andere systemen, zoals interacties tussen eiwitten en nucleïnezuren, single-molecule spectroscopie en de studie van moleculen in beperkte ruimtes. Begin met het brengen van de stem naar een versnellingsspanning.

Laad vervolgens een SPI siliciumnitride-windowgrid in de TEM-proefhouder. Reinig het grid gedurende 30 seconden met zuurstofplasma om vuil te verwijderen. Plaats de proefhouder in de TEM en wacht tot het vacuüm is opgepompt voordat het monster wordt geladen.

Zoek met de brightfield TEM-modus het nitride-venster, een helder vierkant op het ruwe rogram. Zorg ervoor dat de TEM correct is uitgelijnd. Lijn vervolgens het monster uit en stel het scherp.

Zet het systeem nu in STEM-modus en gebruik een hot off-detector om het monster af te beelden en de uitlijning te controleren. Stel de monochromator, indien aanwezig, in op een lage waarde, zodat er een hogere elektronenstroom beschikbaar is voor het boren. Selecteer de juiste spotgrootte om de nanopore te boren op basis van de diameter van de elektronenbundel.

Zorg dat de steel is uitgelijnd. Gebruik de BROGRAM om bij de vereiste vergroting scherp te stellen op het nitridemembraan. Indien het monster beweegt, schakel dan de elektronenbundel uit (blank) en wacht tot het monster is gestabiliseerd.

Dit kan tot een uur duren. Plaats, zodra het gestabiliseerd is, de elektronenbundel op het monster en begin met het boren van de nanoporie. Het boren van een nanoporie met een TM vereist veel geduld.

Het is een proces waarbij nitride geleidelijk wordt weggeslagen onder een elektronenbundelprobe. Het is belangrijk om de elektronenprobe direct boven de boorplaats te houden en te bevestigen dat de nanopore volledig is geboord. Controleer de sample periodiek door te scannen met de hot off detector voordat de sample uit de TEM wordt verwijderd.

Als het monster licht verschuift, pas dan de positie van de elektronenbundel aan zodat deze zich boven de nanopore bevindt. Wanneer het ROI-gram in focus is, zal de glinsterende nitridefilm verdwijnen. Wanneer de nanopore zich vormt terwijl het roky-gram buiten focus is, is de rafelige nagelrand zichtbaar.

Neem een beeld op van de nanopore terwijl de verwarming is uitgeschakeld en maak een intensiteitsprofiel van het beeld. De diameter van de nanopore kan worden geschat aan de hand van het donkerste gebied van het profiel. De elektronenbundel kan worden gebruikt om de nanopore te vergroten indien nodig.

Zodra de gewenste diameter is bereikt, schakelt u over naar de TEM-modus met de monochromator in de standaardinstelling. Gebruik brightfield TEM om de poriegrootte te bevestigen.

Begin met het voorbereiden van ontgaste fysiologische zoutoplossing. Plaats de oplossing onder vacuüm in een sonicaatbad gedurende 20 minuten. Plaats voorzichtig de fragiele nanopore-chip met siliciumnitride in een Pyrex-bekerglas van 10 milliliter. Plaats het bekerglas vervolgens in een zuurkast op een warmteplaat.

Reinig de Nanopore-chip zeer zorgvuldig met piranha-oplossing. Voeg eerst drie milliliter zwavelzuur toe aan de houder met een glazen pipette. Voeg vervolgens voorzichtig één milliliter geconcentreerd waterstofperoxide toe aan het zwavelzuur.

Neem alle voorzorgsmaatregelen. Laat de nanopore-chip 10 minuten weken. Verwijder vervolgens met een glazen pipet de piranha-oplossing uit het bekerglas en voer deze op de juiste wijze af.

Vul vervolgens het bekerglas met ontgaste gedeioniseerde water. Leeg het bekerglas met een schone glazen pipet en herhaal dit wassen ten minste vijf keer. Verwijder de nanopore chip met een schone pincet en droog deze door middel van lichte zuiging.

Zodra deze droog is, moet de nanopore-chip onmiddellijk in de kamer worden verzegeld. De chip kan in de kamer worden vastgezet met O-ringen of siliconenkit. Vul de kamer met een kaliumchloride-oplossing.

Sluit de zilver/zilverchloride-elektroden aan op de kamer. Elektroden kunnen worden gemaakt door zilverdraad een nacht in bleekmiddel te weken. Breng een transmembraanpotentiaal aan over de elektroden en monitor de stroomrespons met een patchclamp-versterker.

Stel in de voltage-clamp-modus een stroom-spanningscurve op op basis van de metingen. De curve moet sterk lineair zijn. Bij gebruik van één molair kaliumchloride moet de conductantie van de nanoporie overeenkomen met de diameter ervan.

Als de nanopore geen lineaire IV-curve vertoont, is de conductantie te laag of is de open stroom van de nanopore niet stabiel. Dit wijst erop dat de nanopore niet correct is verbonden en dat het piha-wassen moet worden herhaald. Het is essentieel om er zeker van te zijn dat er vloeistof in de nanopore aanwezig is.

Indien deze stap niet correct wordt uitgevoerd, zal de ionenstroom door de nanopore een zeer grote ruis vertonen en zal de partitionering van eiwitten in de nanopore drastisch afnemen. Begin met het toevoegen van een gezuiverd monster van het betreffende eiwit in het geaarde bad van de kamer. Wacht tot het monster volledig is gediffundeerd.

Breng een transmembraan potentiaalspanningsbias aan met een polariteit die tegengesteld is aan die van de totale lading van het bestudeerde eiwit. Een aangelegde potentiaal van 200 millivolt zou voldoende moeten zijn om waarnemingen te doen. De meeste gebeurtenissen van eiwitanalieten zullen verschijnen als kortstondige stroomafbuigingen ten opzichte van de basislijn.

Indien er geen signaal wordt waargenomen, verhoog dan de concentratie van het eiwit in de kamer. Hogere voltages verbeteren de signaal-ruisverhouding en het nitride. Nanoporiën kunnen meerdere volts verdragen.

Proteïneabsorpties zullen verschijnen als langdurige veranderingen in de basisstroom van de nanopore. Typische resultaten voor solid-state nanoporen zullen als volgt zijn. De open porestroom moet zeer stabiel zijn.

De IV-karakteristieken van de nanopore moeten sterk lineair zijn. In één molair kaliumchloride en 10 molair kaliumfosfaat bij pH 7.4 zal de helling van een lineaire fit van de IV-curve de unittestige conductantie van de nanopore opleveren. De conductantie heeft een directe relatie met de diameter van de nanopore en moet overeenkomen met de vergelijking.

Deze waarde moet binnen 30% overeenstemmen. Als de waarde te laag is, is de porie waarschijnlijk niet verbonden na toevoeging van eiwit. Snelle gebeurtenissen zouden moeten volgen; eiwitabsorptie is een langdurige daling van de stroom. Sommige eiwitten zijn zeer labiel en ondergaan structurele transformaties binnen het interieur van de porie.

In dit geval zal de langdurige spanningsval gepaard gaan met snelle fluctuaties. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u solid-state nanoporiën vervaardigt met behulp van een scanning transmissie-elektronenmicroscoop, en hoe u deze gebruikt voor de absorptie van gepositioneerde SA-eiwitten. Vergeet niet dat werken met piranha-oplossing uiterst gevaarlijk kan zijn; bij het uitvoeren van deze procedure moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het werken in een zuurkast met handschoenen, een laboratoriumjas en een chemisch schort.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.