Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast

Het algemene doel van het volgende experiment is om de subnucleaire organisatie in gistcellen kwantitatief te meten en te bepalen hoe deze wordt beïnvloed door veranderingen in groeicondities of mutaties. Dit wordt bereikt door gistcellen te kweken tot de log-fase onder condities die autofluorescentie minimaliseren. Vervolgens worden de cellen in een groeikamer geplaatst voor observatie onder de microscoop.

Vervolgens worden afbeeldingen gemaakt om de afstand tussen verschillende fluorescentielabelstructuren in de cel te meten. De resultaten tonen verschillen in de niet-nucleaire organisatie aan, welke afhankelijk is van het wijzigen van de nutritionele omstandigheden tijdens de groei van de gistcultuur. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van de epigenetica over de wisselwerking tussen subnucleaire organisatie van chromatine en genregulatie.

Voor vis en gist wordt gestart met het bereiden van Edinburgh minimaal medium of EMM, en EMM met ammoniumchloride om autofluorescentie te verminderen, in plaats van te autoclaveren. Gebruik een 0,2 micron filter om de glucosoplossing te steriliseren en voeg deze toe aan de geautoclaveerde media. Inoculeer drie milliliter EMM in 30 milliliter buizen met vis- en gistcellen.

Vers opgekweekt op een agarplaat in het rijke medium YEA, sluit de buizen lichtjes af met een dop en incubeer de cellen in een schudmachine bij 225 RPM en 30 graden Celsius. Houd de cellen gedurende twee dagen in de logfase door ze elke ochtend en avond te tellen met een birka-kamertje en ze te verdunnen tot de juiste dichtheid. Op de dag van het experiment.

De cellen moeten zich in een vroege log-fase bevinden ten opzichte van de stikstofvoorraad. Volg de procedure beschreven in het schriftelijke protocol om de cellen als één pellet onderin een centrifugebuis te verzamelen; centrifugeer 1,5 milliliter cellen in een Eppendorf-buis bij maximaal 1,5 RCF door de buis eerst twee minuten te centrifugeren en deze vervolgens 180 graden te draaien voor een tweede spin van twee minuten. Verwijder alle supernatant behalve 10 tot 15 µL en resuspendeer de cellen in het resterende medium, waarna een aliquot van 1 mg/mL filtergestabiliseerde lectine wordt toegevoegd.

Voeg vijf µL lectineoplossing toe aan de hoek van het dekglas en voeg vijf µL cultuur toe aan de lectinedruppel. Om een groeikamer van S pom basiscellen te creëren, pipetteer vijf µL EMM op een schoon objectglas en keer het dekglas met de cultuur in een hoek van 70 graden over het medium en laat het recht naar beneden op de EMM vallen om de randen met siliconenvet af te dichten. Knip het brede uiteinde van een 200 µL tip af en bevestig het smalle uiteinde aan een spuit van twee mL.

Vul de spuit met ongeveer één milliliter siliconenvet. Breng een dunne lijn siliconen aan op de randen van het dekglas door de zuiger van de spuit voorzichtig in te drukken om de groeikamer af te dichten. Begin met het gebruik van Brightfield Imaging om de cellen te lokaliseren en uit te graven.

Krijg een scherp beeld voor confocale microscopie. Wij maken gebruik van een Zeiss LSM 700 laser-scanning microscoop met een plan apoch chromat 63× olie-objectief en een instelling voor een gemiddelde vlakscan over 16 lijnen. Stel de area units in op 1 tot 1,1 om een optische doorsnede van 0,8 microns te verkrijgen.

Scan de cellen met lasers die Alexa 488 en mCherry of GFP detecteren. Neem voldoende beelden op om metingen te verrichten in 60 cellen per drain. Schakel over naar een nieuwe groeikamer met verse cellen.

Open na 60 minuten beeldvorming een afbeelding in het programma Zeen Light Edition om de afstand tussen signalen van verschillende fluoroforen in hetzelfde brandvlak te meten. Open de meettool en pas de lichtintensiteit en het contrast aan om het centrum van elk fluorescent signaal te identificeren, bijvoorbeeld het spoelpoollichaam en het kernmembraan, en meet de afstand tussen deze twee. Draag de gegevens over naar een notitieblok.

Vergelijk de gemiddelde of mediane subcellulaire afstanden tussen verschillende stammen en behandelingen met behulp van statistische software of toetsen zoals de T-toets of de Mann-Whitney U-toets. In dit voorbeeld werd stam PJ 1 18 5 gekweekt in EMM en werd een monster in een groeikamer geplaatst voor beeldvorming. Vervolgens werd een aliquot van PJ 1 18 5.

De cultuur werd overgebracht naar EMMN en 15 minuten geïncubeerd voordat een monster in een groeikamer werd geplaatst voor beeldvorming. Het meetinstrument werd gebruikt om de afstand tussen de locus en het spoelpoollichaam, evenals tussen de locus en het kernmembraan, te meten. Zoals hier wordt getoond, was er een statistisch significant verschil in de afstand waarbij het gencluster zich verwijderde van het kernmembraan richting het spoelpoollichaam in de stikstofarme cellen vergeleken met cellen die in stikstof waren gekweekt.

De gegevens voor de afstand tussen het GFP en het SBP vertoonden een normale verdeling, waardoor de gemiddelde afstanden konden worden vergeleken met behulp van een T-test. Er was een significant verschil tussen de twee gemiddelde waarden. De gegevens voor de afstand tussen het GFP en NM vertoonden geen normale verdeling, waardoor de mediaanafstanden werden vergeleken met behulp van een Mann-Whitney U-test.

Er was een significant verschil tussen de twee mediaanwaarden na het volgen van deze procedure. Andere methoden, zoals real-time PCR, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over hoe het genexpressieniveau correleert met de veranderingen in de subnucleaire organisatie.