Identificatie van eiwit Interactie partners met behulp van Tandem Affinity Purification

Het algemene doel van deze procedure is om een methode genaamd tandem-affiniteitszuivering te gebruiken om eiwitbindende partners te isoleren. Hallo, ik ben dLAN Bailey van de sectie Virologie aan het Imperial College London. In ons laboratorium werken we aan virus-gastheerinteracties voor verschillende leden van de virusfamilie.

Het identificeren van eiwitten die interageren met andere cellulaire of virale eiwitten is een uitstekend startpunt voor het onderzoeken van de wisselwerking tussen het virus en de gastheer tijdens een infectie. In deze video leg ik een benadering uit die we in ons laboratorium gebruiken: tandem affinity purification of tap-tagging. De Tap-tag die in deze studie wordt gebruikt, is een N-terminale tag bestaande uit twee eenheden proteïne G en een streptavidine-bindend peptide.

Deze zijn gescheiden door een TEV-protease-splitsingssequentie die specifieke elutie van het lokeiwit mogelijk maakt. In dit voorbeeld bevindt het muis-eIF4E zich aan de C-terminus van dit fusieconstruct. Het TAP-tagging-protocol is een procedure in zes stappen.

Na transfectie en het genereren van cellijnen worden de cellen geïnduceerd om het tag-abate-eiwit tot expressie te brengen voordat ze worden gelyseerd in een milde lysisbuffer. Twee affiniteitszuiveringsstappen en twee specifieke oplossingen worden gebruikt om het lokaas en eventuele potentiële interagerende partners te zuiveren om cellijnen te genereren. HEK 293-cellen moeten worden getransfecteerd met de P met vier expressievector die codeert voor.

De cellen met het TAP-getagde lokaasteiwit worden vervolgens geselecteerd met 100 µg/ml hygromycine B. Omdat het plasmide episomaal behouden blijft, is het niet nodig om specifieke klonen te isoleren. 10 confluente flessen cellen worden geïnduceerd door behandeling met 10 µM cadmiumchloride gedurende 16 uur, waarna ze in medium worden afgeschraapt. De gesuspendeerde cellen worden vervolgens overgebracht naar 15 mL-buisjes en de cellen worden door centrifugatie gepelleteerd.

Deze cellen worden vervolgens drie keer gewassen met ijskoud PBS voordat ze uiteindelijk worden gecentrifugeerd tot een pellet. Stap twee: cellyse. De cellen worden gelyseerd in 5 mL koude lysisbuffer door herhaaldelijk pipetteren, waarna ze vijf minuten op ijs worden bewaard. Om een efficiënte lyse te garanderen, worden de cellen vervolgens door een smalle, stompe naald gespoten en onderworpen aan vries-dooi-cycli.

Het resulterende lysaat wordt verdeeld over 1,5 ml buisjes en ongelyste cellen en debris worden door centrifugatie verwijderd. Let op dat de grootte van de pellet na deze centrifugatiestap aanzienlijk is verminderd. De supernatanten van het lysaat worden vervolgens samengevoegd in een 15 ml Falcon-buis en door een 0,45 micrometer filter geleid om eventueel overgebleven debris te verwijderen.

Er moeten aliquota's van 50 µL van dit lysaat worden genomen voor verdere analyse. Dit monster wordt aangeduid als monster één. Stap drie, binding aan konijn IgG Aeros.

In deze fase van het protocol worden de proteïne G-tags geïmmunoprecipiteerd met rabbit IgG aros. Om de aros-beads over te brengen, dient het uiteinde van de pipetpunt te worden verwijderd. Dit helpt om beschadiging van de beads te voorkomen.

Resuspendeer de rabbit IgG-beads voorzichtig door de fles te draaien voordat u de beads overbrengt naar een buis van 15 ml. Was de beads drie keer in gekoelde lysisbuffer en gebruik bij elke stap centrifugatie op lage snelheid om de beads te klaren. De gepelleteerde rabbit IgG-beads moeten na centrifugatie zichtbaar zijn.

Verwijder na elke stap voorzichtig de buffer zonder de kraaltjes te verstoren. Voeg na voltooiing van de laatste wasstap het gefilterde en geklaarde lysaat toe aan de gepakte kraaltjes en incubeer dit gedurende drie uur of een nacht. Bij voorkeur gebeurt dit bij vier graden C met gebruik van een roterende mengmachine.

Centrifuge na de immunoprecipitatie de agros-beads en verwijder het supernatant voor een daaropvolgende analyse. Indien nodig kunt u een fijne pipetpunt gebruiken om alle resterende vloeistof uit deze buis te verwijderen. Dit supernatant is monster twee stap vier TEV-protease splitsing.

In deze stap wordt de bait losgekoppeld van de proteïne G-tags. Deze stap maakt specifieke splitsing van het bait-eiwit mogelijk, wat in feite een elutiestap is uit de rabbit IgG-beads immunoprecipitatie. Bereid het TEV-splitsingsmengsel en voeg dit toe aan de beads met behulp van een pipetpunt waarvan het uiteinde is verwijderd; overbreng dit mengsel naar een gesiliconiseerde microcentrifugebuis en keer deze om om de beads in suspensie te brengen voorafgaand aan de incubatie gedurende de nacht bij 4 °C. Neem een aliquot van deze TEV-splitsingsreactie af voor analyse.

Dit is monster drie. Incubatie gedurende de nacht op de roterende mixer zou de TEV-reactie tot bijna volledige voltooiing moeten laten verlopen. Stap vijf, binding om streptavidine-beads te immobiliseren.

In deze stap worden het Cleve-aas en eventuele potentiële bindingspartners affiniteitsgezuiverd uit de oplossing. Centrifugeer eerst de TEV-splitsingsreactie die de rabbit IgG aros-beads bevat. Verwijder een OTT van het geklaarde supernatant voor analyse om de aros-beads te pelletteren.

Dit is monster vier. Verwijder voorzichtig al het resterende supernatant, dat uw lokaisteiwit bevat, naar een nieuwe buis. Gebruik hiervoor opnieuw een fijne tip.

Gebruik pipetpuntjes om al het mogelijke supernat remove. Bewaar de rabbit IgG aros beads voor latere analyse. Dit is monster vijf.

Om beschadiging van de strep-avidin-beads te voorkomen, verwijdert u de punt van een pipetpunt. Resuspendeer de beads voorzichtig en breng een aliquot over naar een gesiliconiseerde buis. Was de beads die strep bevatten met S-buffer en klaarlen deze door middel van centrifugatie bij lage snelheid.

Na elke wasbeurt. Verwijder na elke wasbeurt voorzichtig de buffer. Streptavidine-beads zijn zeer klein en kunnen gemakkelijk worden verplaatst, zelfs bij gebruik van een fijne pipetpunt.

Bereid de pet-tips voor. Nadat de streptavidine-beads zijn gewassen, voegt u het supernatant van de TEV-splitsingsreactie toe aan deze beads en laat u de reactie drie uur of overnacht incuberen bij 4 °C met behulp van een roterende mengmachine.

Centrifugeer na incubatie de streptavidine-beads en verwijder het supernatant. Dit is monster zes. Ter informatie.

Het Beit-eiwit is nu gebonden aan de resterende kraaltjes in de buis. Was de streptavidine-kraaltjes die uw lokaas-eiwit bevatten met lysisbuffer. Om eventuele overige contaminerende eiwitten te verwijderen, verwijdert u de resterende wasoplossing van de kraaltjes en bewaart u deze op ijs.

Stap zes, biotin-elutie. In deze stap wordt biotine toegevoegd aan de streptavidine-beads. De interactie tussen biotine en de streptavidine-beads verdringt het aas, waardoor dit terug in de oplossing gaat.

Voeg de biotinoplossing direct toe aan de beads en keer de buis om om te mengen. Incubeer de reactie drie uur of overnight bij vier graden C met behulp van een roterende mengcentrifuge, meng de biotin aeros-mix en verzamel het mengsel zorgvuldig in een nieuwe buis. Dit is uw uiteindelijke EIT, aangeduid als monster zeven.

De resterende strept havering-beads zijn monster acht. Vanwege de lage eiwitconcentratie moet dit laatste eluaat vóór de analyse worden geconcentreerd. Dit wordt bereikt met behulp van spin-kolommen met een laag moleculair gewicht (cut-off), waarbij het volume door centrifugatie wordt verminderd en het proces regelmatig wordt gemonitord.

Dit geconcentreerde monster kan worden gesplitst en geanalyseerd op SDS-PAGE-gels met Coomassie- en zilverkleuring. Als de monsters via massaspectrometrie worden geanalyseerd, adviseren wij het gebruik van commerciële gegoten gels. Individuele banden kunnen vervolgens worden geëxtraheerd en de eiwitten via massaspectrometrie worden geïdentificeerd.

In dit geval was het lokaas muis-EIF voor het E-eiwit. Het voordeel van het TAP-systeem is dat u de mogelijkheid heeft om uw eiwit van interesse in een specifieke cellijn te tot expressie te brengen en, afhankelijk van de cellijn waarin u geïnteresseerd bent, biedt het u ook de mogelijkheid om het eiwit op relatief lage niveaus tot expressie te brengen, indien u dat wenst, waarbij alle posttranslationele modificaties en lokalisaties behouden blijven, zodat u vaak het oorspronkelijke complex kunt zuiveren.