Identificatie en karakterisering van proteïne glycosylering met behulp van specifieke endo-en exoglycosidases

Het algemene doel van het volgende experiment is om het gebruik van glycosate te illustreren voor de enzymatische deglycosylering en analyse van n- en O-gekoppelde glycosylering op een modelglycoproteïne. Dit wordt bereikt door een glycoproteïne te behandelen met PGA's F of met de proteïnedeglycosyleringsmix. Daarnaast werd de proteïnedeglycosyleringsmix aangevuld met een mengsel van extra exo-glycosidasen, die soms helpen bij het verwijderen van anderszins resistente suikers.

We illustreren deze methode aan de hand van een modelglycoproteïne, recombinant humaan choriongonadotropine bèta, of HCG bèta, gevolgd door SDS-PAGE, Coomassie-blauw kleuring en een suikerspecifieke kleuringsmethode. Pro Q Emerald 300 wordt gebruikt om de glycosylering te analyseren. De resultaten van de HCG bèta-monsters laten zien dat HCG bèta heterogeen geglycosyleerd is en meerdere glycovormen bevat, gebaseerd op de verschillen in eiwitmigratie met en zonder glycosidasebehandeling en het afnemende signaal bij ProQ-kleuring naarmate de glycanen opeenvolgend worden verwijderd.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals massaspectrometrie-analyse, is dat deze eenvoudig is, gebruikmaakt van gangbare laboratoriumapparatuur en geschikt is voor de beginnende glycobioloog. Deze methode kan cruciale vragen in het glycoveld beantwoorden, zoals de vraag of een eiwit geglycosyleerd is. Om de enzymatische deglycosylering te starten, ontdooit u de meegeleverde buffers uit de proteïnedeglycosyleringskit.

Meng de buisjes grondig en bewaar ze bij kamertemperatuur. Plaats de vials met enzymen op ijs, los de inhoud van de HCG beta vial op in 600 µL gedestilleerd water en bewaar dit op ijs. Bereid één milliliter van een 1X G7-buffer door de 10x stock op te lossen in gedestilleerd water en gebruik vervolgens 25 µL hiervan om 0,5 µL PGA's f te verdunnen.

Bereid de exo-glycosidase-mix voor door telkens twee microliters van de vier exo-glycosidases samen te voegen. Voeg vervolgens HCG beta en 10 x glycoproteïne-denaturatiebuffer toe aan zeven genummerde PCR-buisjes zoals aangegeven in het schriftelijke protocol, sluit de buisjes en meng voorzichtig. Denatureer de eiwitten in de thermocycler door 10 minuten te incuberen bij 94 degrees Celsius, gevolgd door een hold bij four degrees Celsius. Centrifugeer de buisjes na het verwijderen uit de thermocycler om eventuele zichtbare condensatie te verwijderen. Voeg aan elk reactiebuisje de resterende reagentia toe volgens het schriftelijke protocol. Sluit de PCR-buisjes met nieuwe dopjes.

Meng de buisjes vervolgens door ze vier keer voorzichtig te tikken nadat de inhoud is gecentrifugeerd, plaats de buisjes in de thermocycler en incubeer deze gedurende vier uur bij 37 °C. Koel de monsters daarna af tot 4 °C. Bereid voor de SDS-PAGE verse 3 x reducerende SDS-laadbuffer.

Voeg met DTT 12,5 µL van de bereide drie x reducerende SDS-laadbuffer toe aan elk monster, sluit de buisjes met nieuwe doppen en tik zachtjes tegen de buisjes om te mengen. Incubeer de buisjes in een thermocycler bij 94 °C gedurende vijf minuten en koel ze vervolgens af tot 4 °C. Laad na incubatie 30 µL van elk monster en 10 µL van de eiwitmarker op een 10 tot 20% tri-glycine gel. Bewaar het resterende deel van elk monster.

Voer elektroforese uit op de gel bij 130 volt totdat het kleurfront zich nabij de onderkant van de gel bevindt. Wanneer de run is voltooid, verwijder dan de gel uit de mal en plaats deze in een kleine plastic bak met voldoende kumasi blue-kleuringsvloeistof om de gel volledig te bedekken. Laat de gel gedurende één uur kleuren onder milde agitatie.

Was drie keer gedurende 30 minuten. Leg de beelden vast met een witlicht-transilluminator of scanner in 50 milliliter detain-oplossing. Als alternatief kan de gel worden gedroogd tussen vellen cellofaan.

Laad in een frame het resterende deel van elk monster en een eiwitmarker op een 10 tot 20% Tri-glycine gel terwijl de gel loopt. Los het ProQ emerald-reagens op met DMF en bereid de stock-fixeer-, was- en oxidatielösungen voor de kleuring volgens de producthandleiding die bij de kit is geleverd. Wanneer de elektroforese is voltooid, verwijder dan de gel uit de mal en plaats deze in een plastic bak.

Fixeer de gel door 100 milliliters van de bereide fixeeroplossing toe te voegen. Laat de gel een nacht bij kamertemperatuur staan onder milde agitatie. Was de gel gedurende 10 tot 20 minuten bij kamertemperatuur met 100 milliliters van de bereide wasoplossing onder milde agitatie, en herhaal deze wasstap een tweede keer met verse wasoplossing.

Oxideer vervolgens de koolhydraten door de gel 30 minuten met zachte agitatie te incuberen in 25 milliliters van de bereide oxidatielosuning, gevolgd door twee extra wasbeurten terwijl de gel wordt gewassen. Bereid verse ProQ emerald 300-kleurstof door 500 microliters ProQ Emerald 300-reagensoplossing toe te voegen aan 25 milliliters van de in de kit meegeleverde kleuringsbuffer. Kleur de gel door deze na de gelkleuring 90 tot 120 minuten onder donkere omstandigheden met zachte agitatie te incuberen in de bereide kleurstof.

Herhaal de twee wasstappen zoals eerder beschreven. Leg vervolgens de beelden vast met een UV-transilluminator bij 300 nanometers. Vergelijk als laatste stap de beelden van de met Coomassie gekleurde gel met de ProQ Emerald-gekleurde gel.

De veranderingen in eiwitmigratie na enzymatische deglycosylering zijn zichtbaar wanneer het controlemonster wordt vergeleken met de F-behandeling van PGA. Om n-glycanen te verwijderen en bij de behandeling met de deglycosyleringsmix om n- en O-glycanen te verwijderen, is er geen verdere afname in grootte waarneembaar na digestie met aanvullend glycosate. Naast een verandering in massa worden de banden scherper naarmate de glycanen worden verwijderd.

Een band die onder de marker van 17 kilodalton loopt, stelt waarschijnlijk het volledig deglycosyleerde HCG beta-polypeptide voor. Banen vijf tot en met zeven tonen de banden die overeenkomen met de Glyco. Andere banden kunnen afkomstig zijn van onvolledige deglycosylering of van meerdere niet-geïdentificeerde eiwitten die aanwezig zijn in het HCG beta-monster.

Het smaragdgroene reagens oxideert en kleurt alle glycanen die in een eiwitmolecuul aanwezig zijn. Daarom neemt de intensiteit van het signaal af naarmate HCG beta enzymatisch wordt gedeglycosyleerd. Het residuele signaal in baan drie en vier duidt op de aanwezigheid van glycaanmotieven die resistent zijn tegen de gebruikte enzymen.

Het aanvullende glycosaat wordt gebruikt in baan vier. Verwijder een paar extra suikerresiduen. De eiwitmigratie is gelijk, maar er is een lichte afname in kleuringsintensiteit zichtbaar.

Resistente suikergroepen waren niet aanwezig in alle eiwitsoorten. Sommige banden werden niet gedetecteerd door Emerald Green, wat erop wijst dat deze uitgebreid waren deglycosyleerd. Aanvullende gegevens ondersteunen de conclusie dat HCG beta heterogeen geglycosyleerd is. De onderste band in baan twee is zwak zichtbaar op de Emerald Green-afbeelding.

Hoewel de bovenste band in baan twee helder is, wat aangeeft dat er nog veel GLYCAN-groepen aanwezig zijn, ondersteunen deze gegevens de conclusie dat recombinant HCG beta dat tot expressie is gebracht in muiscellen meerdere glycovormen bevat vanwege de inherente heterogeniteit van glycosylering. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals massaspectrometrie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals: wat is de bezettingsgraad? Wat is de mate van glycosylering, of wat is de fijnstructuur van de glycanen?

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u glycosylate kunt gebruiken voor de enzymatische deglycosylering en analyse van NNO-gekoppelde glycanen op glycoproteïnen. De keuze van de detectiemethode kan lastig zijn, omdat eiwitkleuringen alleen nuttig zijn als de deglycosylering leidt tot een significante verschuiving in de moleculaire massa voor andere eiwitten.

Wij hebben abnormale migraties waargenomen na deglycosylering en hebben vastgesteld dat elke verandering in de migratie een bewijs is dat het eiwit is gedeglycosyleerd.