Monstervoorbereiding van

Het doel van deze procedure is om celvrije extracten van Mycobacterium tuberculosis te analyseren via NMR-metabolomics; eerst wordt de cultuur opgestart en worden de cellen geoogst in een geschikt groeistadium. Vervolgens worden de cellen gelyseerd om celvrije extracten te verkrijgen voor analyse. De gelyofiliseerde extracten worden daarna resuspendeerd in buffer voor NMR-analyse.

Verzamel tot slot NMR-gegevens en analyseer de spectra met software om metabolieten te identificeren. Uiteindelijk wordt NMR-analyse van mycobacterium tuberculosis gebruikt om aan te tonen hoe metabolietniveaus behouden blijven na verschillende behandelingen. NMR-metabolomics kan worden toegepast op belangrijke aspecten van de fysiologie van mycobacterium tuberculosis, zoals essentiële metabole routes.

Dit inzicht is essentieel om de mechanismen van geneesmiddelwerking en resistentie te verduidelijken en om nieuwe doelwitten voor geneesmiddelontwerp te identificeren. Over het algemeen zouden personen die nieuw zijn met deze methode problemen ervaren door het onvermogen om alle monsters exact hetzelfde te behandelen, wat onnodige variaties in de resultaten van mijn laboratorium zal introduceren. Steven Luka, PhD-promovendus, zal de procedures demonstreren voor het behandelen van de monsters voor NMR-verwerking. Vanuit mijn laboratorium zullen de manager van het onderzoekslaboratorium en Robert Fenton, onderzoekstechnicus drie, nu de procedures demonstreren voor het behandelen van mycobacterium tuberculosis-culturen bij het uitvoeren van M tuberculosis.

Het onderzoek volgde de praktijken voor biosafety level drie zoals gedefinieerd door de institutionele richtlijnen. Hoewel de etiketten in deze video microbacterium tuberculosis vermelden vanwege biosafety-overwegingen, werd in deze demonstratie de niet-pathogene mycobacterium magmatic gebruikt. Begin met het ontdooien van een 50% glycerol-stock van M tuberculosis op ijs.

Inoculeer 0,15 milliliters in 110 milliliters M-A-D-C-T-W-bouillon in de 250 milliliter ER-erlenmeyer en kweek de culturen bij 37 °C met schudden op 100 RPM gedurende ongeveer zes dagen. Indien er geen antibiotica, alternatieve additieven of andere behandelingen nodig zijn. Oogst de culturen voor culturen die behandelingen vereisen.

Reserveer 0,5 milliliter Eloqua op ijs voor kweek, titratie en kwaliteitscontrole. Voer vervolgens de gewenste behandeling uit en plaats de kweken na de behandelperiode terug in de schudmachine. Neem één milliliter af en bepaal de OD 600.

Reserveer daarnaast een monster van 0,5 milliliter voor kweek, titratie en kwaliteitscontrole. Houd de cellen gedurende het gehele resterende protocol op ijs. Oogst de cellen in vier buizen van 50 milliliter door middel van centrifugatie, nadat ze zijn gewassen met 15 milliliter ijskoud dubbel gedestilleerd water.

Resuspendeer de pellets in aliquots van 10 milliliter. Neem twee aliquots en pelletiseer deze door centrifugatie, resuspendeer vervolgens de celpellet in een eindvolume van één milliliter dubbel gedestilleerd water. Indien een enkelcellige suspensie zonder klontering gewenst is, kunnen de cellen door een naald van 27 gauge worden geperst.

Breng driemaal 1 mL celсусpensie over naar een schroefdopbuisje van 2 mL dat lysing matrix B bevat. Plaats de fast prep 24 lysis-homogenisator in de veiligheidskast. Plaats de monsters in de monsterhouder en bevestig de retentieplaat. Verwerk deze vervolgens gedurende 60 seconden bij een snelheidsinstelling van 6 m/s.

Centrifuge vervolgens de monsters om celdebris en intacte cellen te pelletteren. Filtreer daarna het supernatant door een spuitenfilter van 0,2 micron in een steriele buis om de afwezigheid van levensvatbare cellen te controleren. Plaat 0,1 milliliter van het monster op MADC.Agar.

Bevries de monsters in een ethanol-droogijsbad en bewaar deze bij minus 80 °C totdat ze klaar zijn om te worden geliofiliseerd en verwerkt in een NMR-faciliteit. Controleer na twee maanden de platen om de afwezigheid van kolonievormende eenheden te verifiëren. Indien er geen CFU's worden gevonden, kunnen de monsters uit het BSL-3 laboratorium worden verwijderd voor verdere analyse in een standaard NMR-faciliteit.

Nadat de monsters volledig zijn ingedroogd, worden ze opnieuw gesuspendeerd in 0,7 milliliters NMR-buffer en overgebracht naar een microcentrifugebuisje; centrifugeer drie minuten bij 13.000 ×g. Verwijder 0,6 milliliters en breng dit over naar een vijf millimeter NMR-buis. Voor media-analyse vergemakkelijkt een op maat gemaakt rek het laden van meerdere NMR-buizen in spinners op de juiste diepte.

Breng vervolgens de monsters over naar de NMR-spectrometer om ze in de A-B-A-C-S one 20 monsterwisselaar te plaatsen. Wissel hierbij af tussen onbehandelde en met geneesmiddelen behandelde culturen. Het eerste monster moet aan het begin van een geautomatiseerde run vooraf in de magneet worden geladen.

Om het instrument te kalibreren, optimaliseert u de 90 graden polslengte met één enkel monster en stemt u het instrument af voor de resterende monsters. Gebruik de iconen NMR en grad shim. Automatiseer het locken, shimmen en de NMR-dataverzameling voor elk monster.

Selecteer voor een 1D ¹H NMR-spectrum de polssequentie met watersuppressie en excitation sculpting. Stel voor een 2D ¹H-¹³C HSQC-spectrum in totaal 32.000 datapunten, 128 scans en 16 dummy scans in. Selecteer de polssequentie.

Selecteer in totaal 2048 datapunten met sweepbreedte langs de directe H one dimensie en 64 datapunten met sweepbreedte langs de indirecte C 13 dimensie. Specificeer daarnaast de spectrumcollectie met 128 scans en 16 dummy scans om een goede signaal-ruisverhouding te verkrijgen. Een spectrum van m tuberculosis genereerde ongeveer 400 pieken, waaronder 50 bekende metabolieten.

Bijvoorbeeld, de gegevensverwerking zoals gedetailleerd in het bijbehorende manuscript leverde dit spectrum van metabolieten op die direct of indirect geassocieerd zijn met de D-alanine-route. De grootte van de piekintensiteiten is proportioneel aan de metabolietconcentraties in het celextract, waardoor relatieve perturbaties in metabolieten en metabole routes tussen monsters en behandelingen gekwantificeerd kunnen worden. LMR-metabolomics baant de weg voor onderzoekers in het veld van de bacteriologie om de fysiologie en pathogenese te verkennen in visuele en microbacteriën en andere pathogene of niet-pathogene micro-organismen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u meerdere tuberkelcel-extracten bereidt voor NMR-metabolomics en, 무엇보다 belangrijk, hoe u de consistentie gedurende het gehele protocol behoudt om betrouwbare resultaten te verkrijgen.