Techniek Adherent Bacteriën door het creëren van een synthetische Curli Operon

Het algemene doel van het volgende experiment is om bacteriën adhesieve eigenschappen te geven om hun scheiding van vloeibare media te vergemakkelijken. Dit wordt bereikt door eerst een synthetisch curli te ontwerpen om complexe genetische regulatie te omzeilen en de eenvoudige en massale productie van kleverige polymeren mogelijk te maken. Als tweede stap worden adhesieve bacteriën op polystyreen gevisualiseerd en gekwantificeerd, wat een snelle schatting van de efficiëntie van het synthetische systeem mogelijk maakt.

Vervolgens worden adherente bacteriën op glas gevisualiseerd met confocale microscopie. Om de biofilm direct waar te nemen en informatie over de structuur ervan te verkrijgen, worden resultaten behaald die een significante toename van de adherentie tonen in de stam die het synthetische apparaat bevat, gebaseerd op zowel de adherentie- en percentage-meting als op microscopische observaties. Het belangrijkste voordeel van de synthetisch-biologische benadering ten opzichte van bestaande methoden, zoals conventionele klonering, is dat constructen die uitsluitend de absoluut noodzakelijke genen met de juiste signalen bevatten, zeer snel kunnen worden verkregen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van een kernvraag binnen het veld van de bioremediatie, zoals het aanpakken van de uitdaging om metaalbeladen bacteriën uit radioactief afval te verwijderen. Over het algemeen zullen personen die onbekend zijn met deze methode moeite hebben, aangezien basiskennis van genetische regulatiesignalen en het werken met databases vereist is. De visuele demonstratie zal zich richten op de kwantificering en visualisaties van de biofilm, omdat deze twee stappen zeer moeilijk te leren zijn vanwege de fragiliteit van bioframes.

De eerste stap bij het ontwerpen van het synthetische carron is het bepalen van de genetische organisatie van de curly-genen en het lokaliseren van hun endogene transcriptionele en translationele signalen. Dit wordt gerealiseerd met behulp van gespecialiseerde databanken zoals REON DB of eco gene. De volgende stap is het selecteren van de vijf absoluut vereiste genen voor curly-synthese: CSGB en CSGA coderen voor de vezelmonomeren, terwijl C-S-G-E-C-S-G-F en CSGG coderen voor het curling-secretiecomplex. Extraheer de gekozen sequenties uit de databank in FASTA-formaat; het databeheer en de in silico pre-analyse worden uitgevoerd met clone manager-software, aangezien het C-S-G-G-F-E-cluster antisense is in het E. coli-genoom.

Deze sequentie moet worden omgezet in het reverse complement daarvan. Gebruik de bewerkingen van de clone manager tools process molecule invert molecule, plak de C-S-G-E-F-G-sequentie achter C-S-G-B-A met behulp van de functie ligate. Voeg vervolgens de juiste promoter PRCN toe vóór de C-S-G-B-A-E-F-G iCal-sequentie.

De RCN-locus codeert voor een FLX-pomp RCNA, die verantwoordelijk is voor de detoxificatie van nikkel en kobalt, en de bijbehorende metalloregulator RCNR. In afwezigheid van kobalt of nikkel bindt de repressor RCNR aan de RCNR-box op het DNA en voorkomt deze de volledige transcriptionele activatie van de stroomafwaartse genen. Indien de intracellulaire concentratie van kobalt of nikkel stijgt, voorkomt de binding van kobalt of nikkel aan het RCNR-eiwit de fixatie van de repressor aan de promotor, waardoor de transcriptionele activiteit van P-R-C-N-A toeneemt door de vijf geselecteerde curly-genen onder controle van de promotor te plaatsen.

Er wordt voorspeld dat PRCN curly wordt overgeproduceerd in de aanwezigheid van kobalt en nikkel. Optimaliseer vervolgens de transcriptionele signalen door een perfecte ribosoombindingsplaats of RBS toe te voegen vóór het eerste ATG van de CS gba-DNA-sequentie en een tweede perfecte RBS vóór de C-S-G-E-F-G-sequentie. Om te voldoen aan de standaarden van I GMs, moet het device geflankeerd worden door een standaard bio brick-prefix met restrictieplaatsen voor Eco RI en Xba I, en een suffix met restrictieplaatsen voor Spe I en Pst I om verdere assemblage te vergemakkelijken.

Het biobrick-onderdeel zelf mag geen herkenningsplaatsen voor EcoRI, PstI, SpeI en XbaI bevatten. Daarom zijn deze plaatsen verwijderd door middel van stille mutaties. In silico restrictieanalyse van het apparaat onthulde één PstI-plaats in de CSGA-sequentie, één PstI-plaats in de RCNR-sequentie en één EcoRI-plaats in het CSGE-gen. Deze plaatsen zijn gewijzigd via stille mutaties.

Zodra het ontwerp van de synthetische operon is voltooid, wordt er een translatiesimulatie uitgevoerd met behulp van de clone manager-software. Gebruik het sequence alignment-programma blast om perfecte homologie te verifiëren tussen de wild-type curly-eiwitten en de eiwitten die door de synthetische operon worden gecodeerd. Begin deze procedure voor elke well van een 24-well polystyreenplaat met 2 mL M 63 minimaal medium met 0,2% glucose. Inoculeer elke well met 10⁶ cellen van een overnight bacteriële cultuur. Kweek de bacteriën bij 30 °C gedurende 18 tot 48 uur zonder schudden; elke kolom van de 24-well plaat vertegenwoordigt een modaliteit.

De juiste hoeveelheid kobalt en antibioticum wordt toegevoegd wanneer nodig. De eerste drie rijen worden gebruikt om de adherente bacteriën te kwantificeren door het gemiddelde van de drie herhalingen te bepalen. De laatste rij links wordt gebruikt om de biofilm te visualiseren middels kristalvioletkleuring na 18 tot 48 uur; verzamel het supernatant dat de planktonische cellen bevat uit elke put van de eerste drie rijen van de 24-wells plaat en breng het supernatant over naar een hemolysebuis.

Spoel elke put voorzichtig met één milliliter M 63-medium en trek het wasmiddel met het initiële supinaat in de hemolysebuis. Deze pool wordt aangeduid als zwemmende cellen, genaamd S. De bodem van de putten in de microplaat is bedekt met adhesiecellen. Voeg om de biofilm te herstellen één milliliter M 63 aan elke put toe.

Schraap met de pipetpunt en pipetteer vervolgens op en neer, waarna de biofilmfractie wordt overgebracht naar een nieuwe hemolysebuis. Vortex de buis gedurende 15 seconden. Verzamel de biofilmfracties in hemolysebuizen.

Deze pool vertegenwoordigt de aan het oppervlak gehechte cellen, aangeduid als B. Transfer 200 microliters van het supernatant en de biofilmfractie van de hemolysebuizen naar een 96-wellplaat. Schat het aantal aan het oppervlak gehechte en zwemmende bacteriën op basis van de optische dichtheid bij 600 nanometers. Het adhesiepercentage voor elke modaliteit wordt berekend met de formule B keer 100 gedeeld door drie keer S plus B. Om de biofilm te visualiseren voor alleen de laatste rij van de 24-wellplaat, worden de planktoncellen uit deze wells verwijderd.

Voeg één milliliter M 63 toe aan elke well om de biofilm die zich op de bodem van de plaat heeft ontwikkeld te spoelen. Droog de onbedekte plaat gedurende één uur bij 80 °C. Voeg na één uur 100 µL 20% kristalviolet toe aan elke well, gevolgd door uitgebreide wasstappen met water. Voor dit protocol is een fluorescent chassis vereist.

Een geschikte gastheer voor het plasmide dat het synthetische curli draagt, is de E. coli SCC1-stam, die constitutief groen fluorescent proteïne tot expressie brengt zonder waarneembaar verschil met de ouderstam MG1655. Transformeer de gastheerstam met een pUC57-plasmide dat het synthetische curli draagt om de S23-stam te verkrijgen. Transformeer de gastheerstam met een controleplasmide pUC18 om de controlestam te verkrijgen.

Kweek overnacht voorgestelde culturen van de S 23- en S 24-stammen bij 30 °C in M 63-medium aangevuld met glucose en ampicilline. Voeg de volgende dag 20 milliliters M 63-medium toe aan een petrischaal en inoculeer vervolgens 15 milliliters M 63 in petrischalen met 100 microliters van de voorgestelde culturen. Voeg de juiste concentratie kobalt toe en vergeet de negatieve controle zonder kobalt niet.

Plaats drie rechthoekige glazen dekglasjes in elke Petrischaal. Incubeer de schalen gedurende de nacht bij 30 °C zonder schudden. De bacteriën kunnen de volgende dagen direct onder de fluorescentiemicroscoop worden gevisualiseerd.

Het is belangrijk om uitdroging van het monster te voorkomen, dus de volgende stappen moeten zorgvuldig maar snel worden uitgevoerd. Verwijder elk dekglas uit de Petrischalen en laat deze voorzichtig uitlekken. Reinig de onderzijde zorgvuldig met een klein wattenstaafje gedrenkt in 70% ethanol om alle bacteriële residuen te verwijderen voor confocale observatie.

Plaats het dekglas met de biofilm aan de bovenzijde met de biofilm naar boven op een objectglas. De biofilm wordt vervolgens bedekt met een groter dekglas, dat met lak aan het objectglas wordt vastgezet.

Keer de opstelling om zodat de biofilm zich nu aan de onderzijde bevindt. Plaats de opstelling voor dit experiment onder de confocale lasersmicroscoop. Er wordt gebruikgemaakt van een Zeiss LSM 510 Meta confocale lasersmicroscoop binnen het CT micro-platform.

Selecteer het 40x olie-immersieobjectief. Gebruik de volgende instellingen: exciteer GFP bij 488 nanometers en verzamel de bacteriële fluorescentie in het bereik van 500 tot 600 nanometers. Gebruik het 40x olie-immersieobjectief voor het verkrijgen van de beelden.

Scan in de laser-scanning confocale modus de algehele driedimensionale structuren van de biofilms van het vaste oppervlak tot aan de interface met het groeimedium. Gebruik hierbij een stapgrootte van één micron.

Voer driedimensionale projecties uit met de maus-software en bepaal de biofilmdikte door de analyse van de gemiddelde C-waarde langs statistische longitudinale secties. De kwantificering van de biofilm en bio-volumes kan worden geëxtraheerd uit confocale Z-stacks. De adhesiecapaciteiten van e coli die genetisch zijn gemodificeerd om curly te overproduceren als reactie op metaal kunnen worden beoordeeld met eenvoudige methoden.

Bijvoorbeeld, kristalvioletkleuring op gepolijste Irene-platen met 24 putjes maakt een snelle visualisatie van biofilmvorming op de bodem van elk putje mogelijk, zoals blijkt uit het verschil in intensiteit van de paarse kleur. Het lijkt erop dat de wildtype-stam minder adhesief is dan de gemodificeerde stam. Een kwantitatieve methode is het meten van de percentages adhesie op polystyreen van de wildtype- en de gemodificeerde stammen bij verschillende concentraties kobalt.

De resultaten die in deze grafiek worden gepresenteerd, laten zien dat het adhesiepercentage van de gemanipuleerde stam 1,5 keer hoger is dan dat van de wildtype stam in afwezigheid van kobalt. Daarnaast werd een significante versterking van de adhesie waargenomen bij toenemende concentraties kobalt; in media met kobaltconcentraties van 25 µM of 50 µM bereiken de adhesiepercentages van de gemanipuleerde cellen respectievelijk 30% en 40%. De adhesievermogens kunnen ook worden vergeleken met behulp van microscopie met GFP-gelabelde bacteriën gekweekt op glazen objectglaasjes; epi-fluorescentiemicroscopische waarnemingen van groene bacteriën op een zwarte achtergrond onthullen dat de gemanipuleerde stam een biofilm vormt, terwijl de wildtype stam slechts microkolonies vormt, zoals aangegeven door de pijlen.

Confocale microscopieanalyse biedt een totaaloverzicht van de driedimensionale structuur van de biofilm. Reconstructies van het bovenaanzicht worden getoond in panelen A en reconstructies van het zijaanzicht worden getoond in panelen B. De resultaten bevestigen dat de gemodificeerde stam adhesiever is en een dichtere en dikkere biofilm vormt dan het wildtype. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het operationele ontwerp dubbel te controleren, bijvoorbeeld om het potentieel voor bioremediatie van gemodificeerde e coli of occus ants te onderzoeken in de context van radioactief afvalwater.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een synthetisch construct ontwerpt met behulp van clone manager-software en hoe u de expressie van bacteriële stammen snel kunt kwantificeren. Vergeet niet dat het werken met synthetische genen en genetisch gemodificeerde organismen uiterst gevaarlijk kan zijn. Ze moeten worden beheerd volgens de huidige wetgeving en voorzorgsmaatregelen, zoals het autoclaveren van getransformeerde bacteriën, moeten altijd worden in acht genomen bij het uitvoeren van deze procedure.