Site-specifieke bacteriële chromosoom Engineering: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Het algemene doel van het volgende experiment is om een gewenst DNA-construct te integreren in het bacteriële chromosoom op een vooraf bepaald locus. Dit wordt bereikt via een paringsprotocol met vier gemodificeerde bacteriële stammen. De recipientstam heeft een landing pad-sequentie die bestaat uit een spectinomycine-resistentiegen en het e coli bèta-glucuronidase-gen, geflankeerd door ATP-sites die in het chromosoom zijn geïntegreerd.

De donorstam P JH one 10 draagt een plasmide dat B-sites bevat die een stuffer-gen voor een rood fluorescent eiwit en een antibioticumresistentiegen flankeren. De donorstam PJC two draagt een plasmide met de site-specifieke integrase van de streptomyces-faag C 31 onder controle van de LAC-promotor. De vierde stam MT 616 levert de transfergenen die nodig zijn voor conjugatie, waarbij plasmiden van cel naar cel worden overgedragen, wat resulteert in de creatie van trans via de recipientstammen.

Verkrijging van de twee plasmiden die nodig zijn voor integrase-gemedieerde cassette-uitwisseling. De uitwisseling van de donorcassette van het PJ H one 10-plasmide met de markers van de landing pad-cassette op het chromosoom resulteert in het verlies van de landing pad-markers, SPR en UIDA, en het behoud van de donorcassette RFP en GMR in de resulterende trans-immigrant. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals homologe recombinatie, is het gemak en de efficiëntie van het protocol.

Het is bovendien overdraagbaar op een diverse reeks bacteriën. De acceptorstam die in deze video wordt gebruikt, is een S. milli latte-stam. Inoculeer twee dagen vóór de paringsprocedure voor het creëren van trans-integrines vanuit één enkele kolonie in vijf milliliter TY-medium met spectinomycine. Incubeer de S. milli-stam twee dagen bij 30 °C onder schudcondities. Inoculeer de dag vóór de paringsprocedure elk van de volgende E. coli-stammen in vijf milliliter vloeibaar LB-medium aangevuld met het juiste antibioticum: DH5α met het integrase-expressieplasmid in medium met tetracycline, MT616 (de mobilisator) in medium met chloremphenicol en DH5α met het donorcassette-plasmid in medium met gentamycine. Incubeer de drie E. coli-stammen overnight bij 37 °C onder constante schudcondities. Om de cellen voor te bereiden op de paringsprocedure, brengt u 1,5 milliliter van elk van de vier culturen over in een buis en centrifugeert u deze bij 17.000 ×g gedurende 30 seconden om de celpellet te verzamelen. Verwijder het medium en resuspendeer elke celpellet in één milliliter steriele 0,85% natriumchloride. Centrifugeer de buizen opnieuw en resuspendeer na het verwijderen van het supernatant elke pellet in 100 µL steriele 0,85% natriumchloride. Pipetteer individueel 10 µL gewassen cultuur van elke stam op een gewone TY-agarplaat.

Deze spots zijn controle-spots. Voeg vervolgens 40 µL van elke stam, exclusief de e coli DH5α met Pjc2, toe aan een steriele buis en meng dit door herhaaldelijk te pipetteren. Spot 120 µL van dit mengsel op de blanco TY-agarplaat. Deze spot is de negatieve controle zonder integrase.

Voeg ten slotte 40 µL van elk van de vier stammen toe in een steriele mengbuis en spot 160 µL van dit mengsel op dezelfde TDY-agarplaat. Deze spot is de paringsspot voor integrase-gemedieerde cassette-uitwisseling.

Plaats de plaat in een laminaire flowkap en laat de spots daarna ongeveer 20 minuten drogen. Verzegel de plaat en incubeer deze de dag na het mating-protocol overnight bij 30 °C. Strijk de twee controle-spots en de IMCE-mating-spot uit op TY-agarplaten aangevuld met streptomycine en gentamicine.

De S milli acceptorstam draagt een mutatie die een hoge mate van resistentie tegen streptomycine verleent voor de berekening van de IMCE-efficiëntie. Resuspendeer ongeveer een kwart van de IMCE-paringsspot in 500 µL steriele 0,85% natriumchloride. Maak tienvoudige seriële verdunningen tot 10⁻⁷. Plaats verdunningen van 10⁻² tot 10⁻⁵ op TY-agarplaten aangevuld met streptomycine, gentamycine en xgl om trans-immigranten te selecteren. Plaats verdunningen van 10⁻³ tot 10⁻⁷ op TY-agarplaten, aangevuld met streptomycine en xgl om zowel trans-immigranten als potentiële recipienten te selecteren. IE totale recipienten. Incubeer de platen gedurende drie dagen bij 30 °C.

Bekijk RFP trans onder groen licht en door een rood filter; bereken het percentage IMCE-efficiëntie als CFU van trans-immigranten vergeleken met de CFU van het totaal aantal recipiënten. Ongeveer de helft van de trans-cellen zal een werkelijke uitwisseling hebben ondergaan, waardoor ze wit en ongevoelig worden na drie dagen incubatie op Ty aangevuld met streptomycine en gentamycine. Er mag geen groei zijn in de volgende controlestammen: no-integrase controle s milli latte UW 2 27, controle e coli MT 616, controle e coli DH five alpha bevattend P JH one 10 controle en e coli DH five alpha bevattend PJC two controle. In tegenstelling hiermee moet de IMCE-uitstrijk uit de paringsspot confluente groei vertonen op de hoofduitstrijk en vele kolonies op de tweede uitstrijk. De volgende twee afbeeldingen tonen resuspensies van een 10⁻² verdunning van de paringsspot op TY streptomycine xgl agar, en op TY streptomycine gentamycine xgl agar op de TY streptomycine gentamycine xgl agar.

De blauwe kolonies zijn enkelvoudige recombinanten. Terwijl de witte kolonies trans-integrines zijn die een werkelijke cassette-uitwisseling hebben ondergaan wanneer ze onder groen licht en door een rood filter worden bekeken, vertoont de 10⁻² verdunning van de mating spot resus-suspensie op TY strept cin xgl agar geen fluorescentie. Daarentegen vertoont de 10⁻² verdunning van de mating spot resus-suspensie op Ty streptomycin Gentamycin Xgl Agar twee niveaus van fluorescentie.

De helderdere kolonies komen overeen met blauwe kolonies en vertonen een hogere RFP-expressie, vermoedelijk door een read-through vanaf de LAC-promotor in de vector. De minder heldere kolonies komen overeen met witte kolonies, waarbij een daadwerkelijke cassette-uitwisseling heeft plaatsgevonden en die RFP bevatten met enkel de directe promotor en zonder read-through vanaf de LAC-promotor. Deze trends suggereren dat deze kolonies ook spectinomycine-gevoelig zouden moeten zijn.

De efficiëntie van de trans-integratie, uitgedrukt als het percentage trans-immigranten ten opzichte van het totaal aantal recipienten, moet in de range van 0,5% liggen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe bacteriële conjugatie met behulp van onze gemodificeerde stammen kan worden gebruikt om DNA-constructen in het bacteriële chromosoom in te voegen.