Microfluïdische Mixers voor het bestuderen van eiwitten vouwen

Het algemene doel van deze procedure is om twee oplossingen snel te mengen om een biochemische reactie op een microseconde-tijdschaal te starten. Dit wordt bereikt door eerst een microfluïdische menger te fabriceren. De tweede stap is het hechten van een chip aan een dekglas om de kanalen af te dichten.

Vervolgens wordt de chip gemonteerd op een manifold die de reservoirs voor de oplossingen bevat. De laatste stap is het afbeelden van de gemengde oplossing met behulp van confocale fluorescentiemicroscopie. Uiteindelijk wordt de biochemische reactie op een microsecondenschaal vastgelegd door de afstand langs het uitgangskanaal om te zetten in tijd.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals stop-flow menging, is dat de menging niet wordt beperkt door turbulentie en in enkele microseconden plaatsvindt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van eiwitvouwing, zoals wanneer een hydrofobe collaps optreedt? De procedure zal worden gedemonstreerd door Ling Woo, een postdoc in mijn laboratorium, om te beginnen met de fabricage van microfluïdische mengchips.

Reinig eerst vier inch FU silica-wafers met een verse piranha-oplossing, zoals beschreven in het geschreven protocol bij deze video. Gebruik vervolgens een oven voor chemische dampdepositie onder lage druk om een polysiliciumlaag aan te brengen met een dikte van ongeveer één micron voor elke beoogde 10 micron diepte van de uiteindelijke microfluïdische kanalen. Na verdere behandeling van de wafers zoals beschreven in de tekst, breng via spincoating een 900 nanometer dikke laag Z 52 14 fotolak aan op de wafers en voer vervolgens een soft-bake uit op 90 °C direct op een warmteplaat gedurende één minuut, of in een oven op 110 °C gedurende 30 minuten.

Nadat een fotomasker is uitgelijnd, wordt een hard vacuümcontact gemaakt door de fotoresist eerst enkele seconden aan UV-licht bloot te stellen. Ontwikkel vervolgens het patroon in de fotoresist zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Inspecteer de structuren op de wafer met een microscoop en voer een hard bakproces uit op 115 °C direct op een hotplate gedurende twee minuten.

Voer vervolgens een DCU uit op de wafers met een Asher of zuurstofplasma gedurende 2,5 minuten bij een RF-vermogen van 100 watt. Ets met een deep reactive ion etcher de polysilicalaag volledig weg tot aan het onderliggende gesmolten silica. Verwijder de resterende fotolak en behandel de wafer zoals beschreven in de tekst.

Meet de etsdiepte om er zeker van te zijn dat deze volledig door de poly-coating gaat. Gebruik een diep reactieve ionen-etser die geschikt is voor oxiden om gefuseerd silica te etsen tot een diepte van ongeveer 10 micron per micron dikte van de poly-coating. Reinig de wafer met de matrix Asher gedurende vier minuten bij een RF-vermogen van 100 watt, en verwijder het polysilicium met een xenondifluoride-etser. Breng vóór het boren van gaten in de wafer via spin-coating een nieuwe laag photoresist van één micron aan om de kanalen te beschermen tijdens de verdere verwerking.

Monteer vervolgens de wafer met de functionele zijde naar beneden op een opofferingsglasplaat met Aqua Bond 55. Zorg ervoor dat de bonding vrij blijft van bellen en gebruik een computergestuurde diamantboor met micro 90-reinigingsoplossing. Dit voorkomt dat kleine glasfragmenten aan de kanalen kleven, waardoor de chip tijdens gebruik zou kunnen verstoppen.

Ga verder met het boren van ingangs- en uitgangsgaten in elke chip. Spoel de wafer met gedeïoniseerd water door een spuit te gebruiken om water in elk gat te injecteren. Week de wafer vervolgens een uur in zeepsop na het verwijderen van de fotolithografie.

Pas de resist en bonder toe zoals beschreven in de tekst. Spoel de wafer af met gedeïoniseerd water en warm zeepsop. Spoel elk gat opnieuw af met een spuit, waarbij de geëtste structuren worden vermeden nadat er stikstof over de wafer is geleid.

Laat het verder drogen in een vacuümoven die is ingesteld op 120 °C. Inspecteer de gaten om er zeker van te zijn dat ze vrij zijn van vuil en herhaal de reinigingsstappen indien nodig. De volgende stappen moeten in de cleanroom worden uitgevoerd.

Meet de diepte van de kanalen met een optische of mechanische oppervlakteprofielmeter. Reinig de wafer en een dekglas van gefuseerd silica in een cleanroom, zoals beschreven in de tekst. Droog de wafer grondig gedurende ten minste vijf minuten met stikstofgas.

Plaats de wafer vervolgens met de functionele zijde naar boven op een stapel van drie tot vier cleanroom-doekjes, die op hun beurt op een hard, vlak oppervlak zijn geplaatst, zoals een kleine glasplaat. Herhaal dit met het dekglas. Pak het dekglas aan de rand vast en keer het om, zodat de gepolijste zijde naar beneden over de wafer wordt gehouden.

Lijn de vlakke randen zorgvuldig uit, laat het dekglas op de wafer vallen en laat het rusten; verschuif het alleen horizontaal om de uitlijning aan te passen. Druk met één vinger op het midden van de wafer. Men moet een bondingfront zien dat naar buiten toe uitstraalt.

Breng indien nodig extra druk aan op andere posities rond de wafer om het bondingfront verder te laten vorderen. Nadat de verzegelde wafers in een oven bij hoge temperatuur zijn geplaatst, geprogrammeerd volgens het in de tekst vermelde temperatuurprofiel, wordt de wafer met een waferzaag in individuele chips gesneden. Het collectormanifold om de mengchip en oplossingen vast te houden, kan worden gemaakt van kunststof zoals Lexan of plexiglas, of van aluminium.

Voor de temperatuurregeling wordt de chip met kleine o-ringen op het verdeelstuk bevestigd en op zijn plaats gehouden met een borgring die een vrij optisch zicht op het midden van de chip mogelijk maakt. De o-ringgroeven moeten ondieper zijn dan gebruikelijk om een goede aansluiting te garanderen zonder te veel druk op de chip uit te oefenen. Zodra de chip is gemonteerd, worden de oplossingen aan het centrale en de zijdelingse reservoirs toegevoegd, waarbij nauwgezet moet worden gelet op het verwijderen van eventuele luchtbellen die onderin de putjes zijn opgesloten.

Plaats het verdeelstuk op een omgekeerde microscoop en onderzoek het menggebied met het oculair of de camera-output. Een gloeilampzaklamp bovenop het verdeelstuk biedt voldoende licht. Gebruik een kleurstof of een oplossing met een hoge brekingsindex in het centrale kanaal om de straal te kunnen zien.

Omdat de volumes die in deze menger worden gebruikt zo klein zijn, kan de stroming worden geregeld met luchtdruk die boven de oplossingputjes wordt aangelegd. Om de jet te visualiseren, begint u met de druk in het zijkanaal op nul pounds per square inch en verhoogt u deze langzaam tot deze gelijk is aan de druk in het centrale kanaal. Als één zijkanaal verstopt is, zal de jet tegen een van de wanden van het uitgangskanaal worden geduwd.

Als er een zichtbare verstopping optreedt, kan deze worden verholpen door druk of vacuüm uit te oefenen op het uitgangskanaal met een spuit. Indien eiwitten of ander organisch materiaal de chip verstoppen, kan deze worden gereinigd door de chip gedurende de nacht in piranha-oplossing te weken. Leid een gecoate laserstraal in een microscoop van onderzoekskwaliteit met behulp van een dichroïsche spiegel, deze bevindt zich ofwel in of net buiten de microscoop.

Lijn de laser zodanig uit dat de focus in het oculair of de camera enigszins nabij het menggebied zichtbaar is. Fluorescentie van het eiwit in de mengkamer wordt opgevangen door het objectief, via de dichroïsche spiegel geleid, door een lens op een pinhole gefocust en afgebeeld op een fotonteller. Scan de chip met een piëzo-elektrische scanner in x- en y-richting om het menggebied in beeld te brengen.

Kies een positie op de jet en scan in X en Y om de focus in het verticale centrum van het kanaal te vinden. De scherptediepte van de microscoop is veel kleiner dan de kanaaldiepte, en de stroomsnelheid in het kanaal is uniform, behalve binnen één micron van de wanden. Daarom wordt de temporele resolutie van de waargenomen fluorescentie primair bepaald door de grootte van de confocale spot.

Scan horizontaal binnen het uitgangskanaal in stappen van 100 micron langs de jet, waarbij per positie gedurende ongeveer één milliseconde wordt geobserveerd. Verplaats de microscooptafel met 80 tot 90 micron langs de jet om latere tijdstippen vast te leggen. Alternatief kan het licht na de dichroïsche spiegel worden gedetecteerd door een spectrograaf en CCD, waarbij een lens wordt gebruikt om het licht op de ingangsspleet te focussen.

Aangezien de gegevensverzameling trager verloopt dan bij de fotonteller, wordt de jet doorgaans eerst met de fotonteller in beeld gebracht, waarna punten langs de jet met de spectrograaf worden gemeten. De gegevens van de fotonteller worden geanalyseerd door drie tot vijf pixels rond de jet bij elke positie op te tellen om een grafiek van intensiteit tegenover afstand te maken. De tijd wordt uit de afstand berekend met behulp van een berekende snelheid op basis van de toegepaste drukken.

Analyse als laatste stap de gegevens van de spectrograaf met behulp van een van de in de tekst beschreven methoden. Hier wordt een contourplot getoond van de intensiteit in het menggebied, gemeten door de fotonteller. De achtergrond in het uitlaatkanaal buiten de jet moet dicht bij de ruisvloer van de detector liggen en wordt doorgaans niet afgetrokken.

Een hogere achtergrond kan wijzen op een slechte uitlijning of op het feit dat het eiwit aan de wanden van het kanaal kleeft. Omgekeerd duidt een jet die er geknikt of scheef uitziet, vooral nabij het menggebied, op een slechte etsing van de nozzles. Een tijdsondersteunend spectrum wordt getoond van het eiwit ACell coenzyme a binding protein of A CBP gelabeld met Alexa 4 88 en Alexa 6 47.

De groene en rode rechthoeken tonen de golflengten die respectievelijk zijn aangewezen als donor- en acceptorkanalen. Bij deze gegevens is de achtergrond afgetrokken om de donkerstroom en het lasersignaal te verwijderen. Het achtergrondsignaal is gemeten met een druk in het centerkanaal van nul pounds per square inch.

De mengtijd kan worden bepaald door een snelle reactie te meten die veel sneller is dan het mengproces, zoals de quenching van tryptCaanfluorescentie door kaliumjodide. Omdat de jet kleiner is dan de optische resolutie van de microscoop, is er een aanzienlijke daling in intensiteit in het menggebied. Naarmate de jet zich vormt, kan deze instrumentrespons worden verwijderd door een controlemeting uit te voeren waarbij geen enkele oplossingconditie wordt gewijzigd.

De verhouding tussen meng- en niet-mengexperimenten van N-acetyltryptofaanamide-fluorescentie wordt in deze figuur weergegeven. De lijn toont de voorspelde concentratie van kaliumjodide op basis van console multiphysics-modellering en simulaties. De mengtijd, gemeten als de tijd die nodig is voor de concentratie om met 80% af te nemen, bedraagt acht microseconden.

Deze grafiek toont de veranderingen in de FRET van het eiwit A CBP na verdunning van het denatureermiddel van zes molair naar 0,06 molair. Deze gegevens vereisen geen controle-experiment. Aangezien de FRET al een ratio is en de instrumentrespons reeds is verwijderd, vertegenwoordigt de snelle sprong nabij T gelijk aan nul een snelle verandering in het FRET-signaal binnen de mengtijd.

Na deze ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van eivouvouwing om de vroegste stappen in de vorming van de eiwitstructuur te onderzoeken.