Een stap-voor-stap methode voor de Reconstructie van een ABC-transporter in nanodisc lipide deeltjes

Het algemene doel van deze procedure is om een A, b, C-transporter, in dit geval de maltose-transporter malf GK twee, te incorporeren in oplosbare membraan-nanodiskdeeltjes. Dit wordt bereikt door eerst het membraansteuneiwit MSP te mengen met de transporter en de juiste hoeveelheid lipiden in detergentmicellen.

De tweede stap is het toevoegen van polystyreenbolletjes en het mengsel gedurende de nacht voorzichtig te schudden; het detergent wordt geleidelijk door de bolletjes geabsorbeerd, waardoor de nanodisk-deeltjes kunnen worden gevormd. Vervolgens worden de bolletjes door sedimentatie verwijderd. De laatste stap is het scheiden van de correct gevormde disks van aggregaten en niet-geassembleerde steunproteïnen middels gelfiltratiechromatografie.

Ten slotte wordt de kwaliteit van de discs beoordeeld via native gelelektroforese of lichtverstrooiingsspectroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals liposomen, is dat membraanproteïnen en discs volledig oplosbaar zijn in een waterige oplossing. Bovendien zijn de proteïnedomeinen nu van beide zijden toegankelijk.

Aangezien er nu geen membraancompartiment meer is, was ik in staat om, door gebruik te maken van membraansteunproteïnen van verschillende lengtes, de verschillende ligandenstaten van membraaneiwitten vast te leggen en te bestuderen. Belangrijker nog is dat deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de membraanproteomica, zoals de identificatie van nieuwe bindingspartners van a, b, C-transporters. In feite reiken de implicaties van deze techniek verder tot in de therapie, omdat het kan bijdragen aan de ontdekking van activatoren of inhibitoren van membraaneiwitten en receptoren.

Hoewel deze methode eenvoudig lijkt, moet men voorzichtig zijn bij het kiezen van de juiste eiwit-lipidenverhouding. Over het algemeen hebben mensen die nieuw zijn met deze methode moeite met het berekenen van de juiste molaire verhouding of het uitvoeren van de juiste controle om de kwaliteit van de preparatie te waarborgen. Daarom is een visuele demonstratie van deze methode zeer nuttig voor een nieuwe student om de verschillende stappen en potentiële moeilijkheden te leren.

Om hexa-histidine-getagd MSP te kweken in e coli-stam BL 21 DE3 vanuit het plasmide P MSSP 1D1, wordt de eiwitproductie geïnduceerd wanneer de gemeten optische dichtheid bij 600 nanometer ongeveer 0,5 is, gedurende drie uur bij 37 °C. Oogst de cellen door centrifugatie bij 5.000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Resuspendeer het pellet in TSG 10-buffer bevattend 100 µM PMSF. Lyseer de cellen drie keer met een French press bij 8.000 psi. Verwijder het onoplosbare materiaal door centrifugatie bij 5.000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Isoleer vervolgens de oplosbare fractie die de MSP bevat door ultracentrifugatie bij 125.000 ×g gedurende 45 minuten.

Zuiver het MSP door middel van nikkelchelaatchromatografie met gebruik van ongeveer 1,5 milliliter nickel seros high performance in TSG 10 buffer. Was de verontreinigingen weg met TSG 10 buffer met 50 millimolaire ILE elute. Elueer het MSP met TSG 10 buffer met 600 millimolaire I midaz na dialyse.

Het gezuiverde eiwit in TSG 10 buffer MSP kan worden bewaard bij -70 °C met een eiwitconcentratie van ongeveer 10 tot 15 mg/mL. Het MALF GK 2-complex, met een his-tag aan de C-terminus van MAL K, wordt tot expressie gebracht vanuit plasmide PED 22 FG K, gekweekt in E. coli-stam BL 21 DE 3. De eiwitproductie wordt geïnduceerd wanneer de gemeten optische dichtheid bij 600 nm ongeveer 0,5 is, met 0,2% L-arabinose gedurende drie uur bij 37 °C, gevolgd door cellyse en centrifugatie.

Zoals voorheen suspenderen we het membraanpellet in TSG 20-buffer tot een uiteindelijke concentratie van 5 mg/mL. Solubiliseer het materiaal vervolgens met 1% w/v GDM gedurende drie uur bij 4 °C onder zachte schudding. Verwijder het onoplosbare materiaal door ultracentrifugatie, zoals beschreven voor de zuivering van MAL FTK twee.

Verzamel vervolgens de supernatant die het gesolubiliseerde mal FTK two complex bevat en zuiver dit opnieuw met nikkelchelaatchromatografie. Zuiver het complex verder door gelfiltratiechromatografie in TSGD-buffer op een SUEx 200, HR ten driehonderd kolom bij een stroomsnelheid van 0,5 milliliters per minuut. Om fosfolipiden voor te bereiden, wordt een totaal lipidenextract van e coli opgelost in chloroform verdeeld in 1000 anomal aliquots in microcentrifugebuisjes met schroefdop; laat het oplosmiddel verdampen onder een zachte stroom stikstof en droog verder uit gedurende de nacht in vacuüm.

Droog vervolgens het monster, los de lipidefilm op in TS-buffer met een eindconcentratie van vijf NMO, vortex krachtig en pas daarna vijf keer een puls-sonicatie van ongeveer vijf seconden toe. De opgeloste lipiden zullen er licht opaak uitzien vanwege hun algemene onoplosbaarheid in waterige TS-buffer, maar ze moeten in suspensie blijven. Voeg DDM toe tot een eindconcentratie van 0,5%. Op dit punt zal de oplossing helder worden; plaats het lipidenmengsel in een waterbad en pas vijf keer een puls-sonicatie van ongeveer vijf seconden toe.

Het lipidemengsel kan maximaal één week worden bewaard bij vier graden Celsius. Om de bio-beads voor te bereiden, plaatst u ongeveer 10 tot 15 milliliter bio-beads in een buis van 50 milliliter. Was de beads eerst met 50 milliliter 100% methanol.

Laat de beads bezinken door zwaartekracht en schenk vervolgens voorzichtig de oplossing af. Herhaal dit proces één keer met methanol, daarna twee keer met 95%Ethanol en milli Q water, en tot slot met TS-buffer. Begin de nanodiscrete constitutie door MSP te verdunnen in TSGD-buffer tot een eindconcentratie van ongeveer zeven milligram per milliliter of 0,3 millimolar.

Om een succesvol experiment te waarborgen, is het belangrijk om de juiste verhoudingen van lipiden en proteïnen te kiezen die met elkaar gemengd worden. Meng ongeveer twee M gezuiverd malf GK twee complex in een proteïne-te-MS P-te-lipide verhouding van 1:3:60 in TSGD-buffer voor een eindvolume van 300 µL. Hier wordt ook een monster met een overschot aan lipiden in de verhouding 1:3:400 klaargemaakt als negatieve controle. Voeg 50 µL bio-bead suspensie toe aan de buis en incubeer het mengsel overnacht op een schudtafel bij 4 °C. Laat de beads de volgende dag door zwaartekracht bezinken. Zodra de beads zijn neergeslagen, wordt de oplossing via een smalle tip gepipetteerd om zoveel mogelijk bio-beads te vermijden.

Verwijder grote neerslagen door middel van ultracentrifugatie bij 100, 000 GS gedurende 20 minuten. Ga verder met het zuiveren van de schijven via gelfiltratiechromatografie, zoals eerder uitgevoerd in TSG 10-buffer. Injecteer vervolgens een Eloqua op dezelfde gelfiltratiekolom om de stabiliteit van de preparatie te testen.

Voeg vervolgens de fracties die de discs bevatten samen. De kwaliteit van de preparatie wordt beoordeeld via native gel-elektroforese. Analyseer één micromolaire nanodiscs om de kwaliteit van de reconstitutie te beoordelen.

Beoordeel daarnaast de binding van mal E aan het mal ftk twee-complex dat is gereconstitueerd in nanodiscs. Kleur de gel na elektroforese 10 minuten met kumasi blue en ontkleur deze gedurende ongeveer één uur. Om dynamische lichtverstrooiing of DLS uit te voeren, moeten de nanodiscs eerst worden gezuiverd via gelfiltratiechromatografie zoals voorheen, met gebruik van een SUEx 200 HR ten driehonderd-kolom bij een stroomsnelheid van 0,1 milliliters per minuut.

Verzamel de fracties die nanodiscs bevatten en concentreer deze tot ongeveer 10 mg/ml met een AmCon centrifugaalfilter. Filtreer het monster vervolgens twee keer. Voer de analyse uit via DLS met een dynapro nano star-instrument in een kwartsvet met een intern volume van 1 µL.

Gebruik de dynamische software om de diameter en het molecuulgewicht van de deeltjes te schatten en bepaal de activiteit van ATPase van mal FTK twee gereconstitueerde nanodiscs met behulp van een cholestrische assay. Meng eerst één micromolar gezuiverde discs en één millimolar ATP met toenemende hoeveelheden mal e. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij 37 °C.

Meet vervolgens de afgifte van anorganisch fosfaat bij 660 nanometer. Vergelijk de hoeveelheid vrijgekomen fosfaat met een standaardcurve die is gegenereerd met een fosforstandaardoplossing. De nanodiscs worden gezuiverd middels gelfiltratiechromatografie.

Het chromatogram laat zien dat de meeste gereconstitueerde discs elueren als één enkele piek, terwijl discs gemaakt met een overschot aan lipiden elueren in het dode volume en als een reeks brede pieken. De kwaliteit van de disc-preparatie wordt verder geanalyseerd met native gelelektroforese; discs die zijn gereconstitueerd met een beperkte hoeveelheid lipiden migreren als een scherpe band op de native gel, terwijl discs die zijn gereconstitueerd in aanwezigheid van een overschot aan lipiden als vegen migreren. Analyse via DLS laat zien dat de disc-populatie homogeen is met een gemiddelde straal van 5,0 nanometers. Op basis van de DLS-benadering hebben de gereconstitueerde discs een schijnbaar molecuulgewicht van 215 kilodaltons. Monsters die zijn gereconstitueerd in aanwezigheid van een overschot aan lipiden vertonen breed verdeelde stralen rond de 100 nanometers, wat typisch is voor niet-homogene monsters.

De activiteit van het MAL FTK twee-complex wordt beoordeeld door de snelheid van een TP-hydrolyse te meten en de affiniteit voor interactiepartners zoals het maltose-bindende eiwit, MAL E, het maltose-bindende eiwit. MAL E bindt met een hoge affiniteit aan de MAL FTK twee-transporter met behulp van niet-denaturerende gelelektroforese. Het is mogelijk om een complex tussen MAL E en MAL ftk twee te detecteren; de stimulatie van de MAL KA TPA-activiteit door MAL E wordt hier weergegeven als een functie van de MAL e-concentratie.

Het maken van de nanodiscs is relatief eenvoudig, maar kleine afwijkingen van de optimale condities kunnen leiden tot onomkeerbare eiwitaggregatie. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in minder dan twee dagen worden uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met de juiste eiwit-lipideverhouding, aangezien een overschot aan lipiden zal leiden tot de productie van grote polydisperse liposoomachtige deeltjes. Het is daarom cruciaal om de kwaliteit van het gereconstitueerde materiaal zorgvuldig te analyseren met technieken anders dan gelfiltratie, zoals lichtverstrooiingsspectroscopie, analytische ultracentrifugatie of, eenvoudiger, native gelelektroforese.

Onthoud dat zowel het type fosfolipide dat in de disc wordt opgenomen als het membraansteunprotein kunnen bijdragen aan de efficiëntie van de reconstitutie. Na het bekijken van deze video hopen we dat u een goed inzicht heeft gekregen in hoe u oplosbare en homogene nanodiscs kunt genereren die uw gekozen membraaneiwit bevatten. Veel succes met uw experimenten.