Zuivering en Visualisatie van Lipopolysaccharide van Gram-negatieve bacteriën door Hot Waterige-fenolextractie

Het algemene doel van deze procedure is het extraheren van LPS uit Gram-negatieve bacteriën. Dit wordt bereikt door eerst een overnachtcultuur van vijf milliliter bacteriën te kweken in een geschikt medium en de cultuur aan te passen naar een optische dichtheid van 0,5 bij 600 nanometers. Vervolgens worden de bacteriën gepellet door middel van microcentrifugatie en worden de cellen geresuspendeerd in een trisbuffer die SDS en beam of capto ethanol bevat.

Vervolgens worden de cellysaten gekookt en behandeld met protease en nuclease. Ten slotte worden twee opeenvolgende extracties uitgevoerd met warm waterig fenol en diethylether, waarbij de waterige blauwe laag zorgvuldig wordt verwijderd en bewaard. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die zowel de hoeveelheid als de aanwezigheid of afwezigheid van LPS en bacteriële stammen aantonen, evenals de modaliteit van de O-antigeenketenlengte via scheiding door SDS-PAGE en western blot-analyses met LPS-specifieke antilichamen of directe kleuring van de polysachariden in de gel.

Het voordeel van deze techniek ten opzichte van de proteasebehandeling van Hitchcock en Brown is dat deze techniek leidt tot zuivere LPS-monsters die beter kunnen worden gescheiden via SDS-page en western blotting. Deze methode kan inzicht bieden in de synthese en regulatie van lipopolysacharide in VIR in vrijwel elke gramnegatieve bacterie, inclusief e coli en salmonella, evenals in biodefensie- en opkomende pathogenen zoals Ella en Acetobacter respectievelijk om bacteriën te kweken. Zet voor de LPS-extractie een overnachttuuur van gramnegatieve bacteriën op in vijf milliliters LB aangevuld met antibiotica.

Kweek indien nodig de cultuur overnacht in een schudincubator bij 200 RPM en 37 °C. Gebruik LB om de cultuur 1:10 te verdunnen en meet vervolgens de optische dichtheid bij 600 nm op basis van het resultaat. Bereid een suspensie van 1,5 ml bacteriën voor met een uiteindelijke optische dichtheid bij 600 nm van 0,5.

Pellet de bacteriën in een microcentrifuge bij 10 600 ×g gedurende 10 minuten. Verwijder vervolgens het supernatant en gooi dit weg. Bereid voor de extractie van LPS de volgende oplossingen voor: één 1X SDS-buffer, 4% betta me capto ethanol of BME 4% SDS, en 20% glycerol in 0,1 M Tris-HCl pH 6,8 met een snufje bromofenolblauw, en oplossingen van 10 mg/mL DNAse I, RNAse en proteinase K in steriel gedestilleerd water om opnieuw te suspenderen.

Zorg ervoor dat de gepelletteerde bacteriën in 200 µL van een 1X SDS-buffer volledig worden geresuspendeerd door de oplossing herhaaldelijk met een pipet op en neer te zuigen. Kook de gesuspendeerde bacteriën vervolgens langzaam gedurende 15 minuten in een waterbad. Laat de oplossing daarna 15 minuten afkoelen op kamertemperatuur.

Voeg als optionele stap vijf µL van zowel de DNA 1- als de RNA-oplossingen toe enstincubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 37 °C. Voeg 10 µL van de protease K-oplossing toe en incubeer de monsters gedurende drie uur bij 59 °C. Voeg bij elk monster 200 µL ijskoud tris-verzadigd fenol toe.

Sluit de dopjes stevig en vortex elke buis gedurende vijf tot 10 seconden. Incubeer de monsters 15 minuten bij 65 °C. Laat ze, terwijl u af en toe vortexelt, afkoelen tot kamertemperatuur.

Voeg vervolgens onder een zuurkast één milliliter ethyléther op kamertemperatuur toe aan elk monster en vortex dit gedurende vijf tot 10 seconden. Centrifugeer de monsters bij 20.600 ×g gedurende 10 minuten en haal ze voorzichtig uit de centrifuge. Extraheer de onderste blauwe laag uit elk monster, waarbij de bovenste heldere laag wordt vermeden.

Voeg nog 200 µL ijskoud tris, verzadigd fenol toe en herhaal de extractie voor elke buis. Voeg 200 µL tweevoudige SDS-buffer toe. Scheid vijf tot 15 µL van elk LPS-monster op 8% tot 15% SDS-polyacrylamidegels.

Hier wordt een 12% SDS-page gel getoond van LPS-monsters die zijn bereid uit verschillende stammen van bur cold area de losa, geïsoleerd uit sputummonsters van patiënten met cystische fibrose. De verschillende bandpatronen weerspiegelen de verschillende aantallen repeterende eenheden van het O-antigeen die aan de kernoligosachariden zijn gekoppeld. Een vergelijkbaar aantal repeterende eenheden is te zien in monsters één en zes.

Vergeet niet dat werken met fenol-dathylether gevaarlijk kan zijn; voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder een laboratoriumjas, handschoenen en een veiligheidsbril, moeten worden getroffen, en deze experimenten moeten in een zuurkast worden uitgevoerd tijdens deze procedure. Het is belangrijk om de extracties snel uit te voeren, zodat de monsters tijdens de verwerking niet verloren gaan. Na deze procedure moeten Western immuno blotting of methoden om lipopolysachariden te visualiseren via zilverkleuring of andere methoden worden toegepast om de verwantschap tussen de stammen te visualiseren.