High-throughput synthese van koolhydraten en functionalisering van polyanhydride Nanodeeltjes

In dit videoartikel beschrijven we een nieuw hydro-putprotocol voor de geautomatiseerde synthese van oligosachariden in de vloeistoffase en de functionalisering van poly-anhy-nanodeeltjes. Met deze op koolhydraten gebaseerde targeting-agentia worden eerst koolhydraatmoleculen gesynthetiseerd met behulp van een geautomatiseerd systeem dat gebruikmaakt van synthese in de vloeistoffase in plaats van vaste-fase-synthesizers. Vervolgens worden de oligosacharide-intermediaires gezuiverd via florist, vaste-fase-extractie of FSPE.

De geproduceerde koolhydraatmoleculen worden gekarakteriseerd via NMR en vervolgens via carbo-IDE conjugatie gekoppeld aan de polyanhydride nanodeeltjes. Ten slotte worden de koolhydraat-gefunctionaliseerde nanodeeltjes gekarakteriseerd met röntgenfoto-elektronspectroscopie en een hydro-put fenylsulfuurzuur-assay. Uiteindelijk zijn, door gebruik te maken van de hier beschreven hydro-put methodologie, de reactieomstandigheden verkregen om de morfologie van de nanodeeltjes en de koolhydraatdichtheid op het oppervlak van de deeltjes te optimaliseren.

Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande methoden, zoals oligosacharide-synthese op een vaste fase, is dat we bij deze methode een aanzienlijk lagere hoeveelheid bouwstenen gebruiken. In deze methode gebruiken we doorgaans twee tot drie equivalenten in plaats van 10 tot 20 equivalenten. We kregen het idee voor deze methode toen we de effectiviteit van oppervlakte-effecten en de functionalisatie van polyhydro-nanodeeltjes aantoonden, waarbij we koolhydraten gebruikten om specifieke receptoren op anti-denting cellen te targeten. Vervolgens wilden we een high-throughput systeem ontwerpen waarmee we de meerdere parameters kunnen screenen die betrokken zijn bij de fabricage en toepassing van deze nieuwe dragers.

Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de ontwikkeling van geautomatiseerde platforms voor de high-throughput synthese van oligosachariden en hun koppeling aan polymeerdeeltjes een nieuw onderzoeksgebied is waarvoor nog weinig documentatie beschikbaar is. Vóór de geautomatiseerde synthese van dianozuur wordt een geschikt beschermde suikerdonor, doorgaans trichlooracetamide, en een acceptor, hoofdzakelijk in Alcon, fluoreerde alcohol, handmatig gesynthetiseerd en klaargemaakt in chloormethaan. Bereid daarnaast trimethylsilo, trifluoromethaansulfonaat voor in chloormethaan, 80%methanol en 100%methanol. Zorg ervoor dat de relatieve luchtvochtigheid in de kamer in de automatisatiekamer 30% of lager is.

Een hoge luchtvochtigheid is nadelig voor glycosyleringsreacties. De volgende stappen worden uitgevoerd met behulp van een automatiseringsplatform. De eerste glycosylering wordt uitgevoerd met de donor en de florist-alcohol.

Zodra dit is voltooid, wordt het resulterende suikermolecuul met de florist-tag gezuiverd via FSPE. De tijdelijke beschermgroep wordt vervolgens verwijderd met natriummethoxide en methanol, waarna het product opnieuw via FSPE wordt gezuiverd. Daarna wordt de suiker met de florist-tag als acceptor gebruikt en gekoppeld aan dezelfde donor om het disacharide te verkrijgen; dit disacharide wordt gezuiverd via FSPE om het proces te starten.

Plaats de reagentia, waaronder de donor-acceptor-promotor, 80% methanol water, 100% methanol en natriummethoxide, in het robotplatform en start het programma. De robotarm onttrekt de donor en vervolgens de acceptor uit de vials en brengt deze over naar een reactievial. Daarna wordt het mengsel van donor en acceptor 30 minuten geroerd.

Na 30 minuten over te zijn gegaan, brengt de robotarm katalytisch trimethylsilyltrifluormethaansulfonaat over in het mengsel. De oplossing wordt vervolgens nog 30 minuten geroerd. Nadat het roeren is voltooid, wordt het programma gepauzeerd.

Neem een aliquot van 10 µL om via dunlaagchromatografie (TLC) te controleren of de reactie voltooid is. Als de reactie voltooid is, zal het acceptor-molecuul niet meer zichtbaar zijn. Als de reactie niet voltooid is, is de acceptor op de TLC nog steeds zichtbaar.

Als dit het geval is, stop dan het programma, reset de timing voor glycosylering naar ongeveer 30 minuten en voeg een overmaat van de promoter trimethylsilyltrifluormethaansulfonaat toe. Wanneer de reactie is voltooid, ga dan verder met de volgende stap. Zodra de reactie is voltooid, brengt de robot het reactiemengsel over naar FSPE-cartridges die C9 F17-gemodificeerde silicagel bevatten voor zuivering.

Vervolgens worden de cartridges gewassen met 8 mL 80% methanol, gevolgd door 8 mL 100% methanol. Om de non floris-fractie te elimineren, wordt de doorstroom opgevangen in een vial om het gewenste florist-getagde product te verkrijgen. Als extra zuivering nodig is, pauzeer dan de robot en verwijder de betreffende reactieproducten.

Afhankelijk van de structuur kunnen donoren extreem ongeactiveerd zijn, waardoor sommige florist-acceptormoleculen overblijven, zelfs na toevoeging van voldoende promoter. In dat geval zal FSPE niet efficiënt genoeg zijn voor zuivering en kan er na zuivering aanvullende zuivering via silicagel-kolomchromatografie worden uitgevoerd; de robotarm doseert natriummethoxide in het reactiebuisje. De reactie wordt vervolgens twee uur lang geroerd in het robotplatform; indien de reactie volgens TLC nog niet voltooid is, dient de incubatieperiode met ongeveer een uur te worden verlengd.

Na voltooiing van de reactie wordt het product zoals voorheen gezuiverd via FSPE. Verwijder vervolgens het reactieproduct uit de robot en los dit op de werkbank op in watervrij tolueen, gevolgd door verdamping om resterend water te verwijderen. Zodra een monster droog is, wordt het teruggeplaatst in de robot voor dezelfde cyclus, inclusief glycosyleringszuivering via FSPE.

Diepe bescherming van de tijdelijke beschermende groep gevolgd door glycosylering wordt herhaald totdat de gewenste ketenlengte voor het doelmolecuul is bereikt; om het beschermde product verkregen via automatisering te deprotecteren, dient het vial uit de robot te worden verwijderd. De laatste stappen van de procedure maken gebruik van explosief waterstofgas en moeten buiten het automatiseringsplatform worden uitgevoerd. Op het laboratoriumblad vindt lysis van de dubbele binding in de florist-tag plaats, gevolgd door oxidatie van het geproduceerde aldehyde tot carbonzuur.

Zuiver het resulterende product via silica gel kolomchromatografie op een laboratoriumtafel met gebruik van een mengsel van 30% methanol in dichloormethaan. Om vervolgens de benzo-ethergroepen te deprotecteren via palladium-gekatalyseerde hydrogenatie, wordt het product door een satellite pad geleid om palladium te verwijderen en het zuivere eindproduct te verkrijgen. Karakteriseer het product volledig met behulp van nucleaire magnetische resonantie of NMR-spectroscopie.

Polymeersynthese en nanodeeltjesfabricage met een hoge doorvoer worden uitgevoerd volgens het protocol beschreven door Peterson et al. Zoals vermeld in het bijbehorende document, bestaat het geautomatiseerde depositieapparaat dat wordt gebruikt voor de functionalisering van deeltjes uit drie ne 1000-pompen, een robotplatform geïntegreerd door twee actuatoren, één voor beweging in de X-richting en de andere voor beweging in de Y-richting, en een tweede robotplatform met twee aangrenzende rekken bestaande uit drie actuatoren, één voor elke richting waarin de pompen en in totaal vijf actuatoren in serie zijn verbonden. De actuatoren en pompen worden aangestuurd door een computer met behulp van LabVIEW-software.

De copolymeersystemen die worden gebruikt voor de fabricage van deeltjes zijn gebaseerd op SEBA-zuur of SA en één zes bis, paraic carboxy, oxil heane of CPH en één acht BIS para carboxy phenoxy drie zes dioxane of CP Teeg. Na de fabricage van de nanodeeltjes wordt een rek met 1,7 milliliter centrifugebuisjes met een nanodeeltjesbibliotheek op het lineaire actuatorpodium geplaatst voor de koppeling van koolhydraten aan het oppervlak van poly-anhydride deeltjes, waarbij een gemiddelde carbonzuur-koppelingsreactie bestaande uit twee opeenvolgende reacties wordt uitgevoerd; voor de eerste reactie wordt een spuit in een programmeerbare spuitpomp gevuld met een waterige oplossing van EDC en ethyleendiamine bij een concentratie van respectievelijk 2 mg per mg nanodeeltjes en 0,6 mg per mg nanodeeltjes.

Vul een tweede spuit in een programmeerbare spuitenpomp met een waterige oplossing van 2,5 milligram per milligram NHSA-deeltjes, voor een totaal van 12 equivalenten per nanodeeltjesmonster. Instrueer vervolgens de robot via het LabVIEW-programma om de reagenssuspensies in de nanodeeltjesbibliotheek te deposeren. De robotactuatoren verplaatsen vervolgens de buishouder naar de juiste positie op het platform voor het dispenseren van de oplossingen, EDC en NHS.

Activeer de carbonzuurgroepen op het oppervlak van de polyanhydride-nanodeeltjes en laat dit leiden tot een gemiddelde koppeling. Dompel vervolgens een sonicatieprobe in elke buis en soniceer elk monster gedurende 30 seconden bij 40 hertz. Reinig de probe met aceton voordat u overgaat naar het volgende monster.

Zodra alle monsters verzadigd zijn, wordt de buishouder van het robotplatform losgekoppeld. Incubeer de nanodeeltjessuspensies gedurende negen uur met constante rotatie bij 4 °C. De reactietijden voor de eerste en tweede reactie kunnen worden aangepast om de uiteindelijke saccharideconcentratie te reguleren.

Nadat de reactie is voltooid, worden de buisjes vijf minuten gecentrifugeerd bij 12,000 ×g. Keer in een koude omgeving terug naar het robotstation. Bevestig de buishouder opnieuw aan de robotarm en vul de tweede spuit in het robotplatform.

Bij gebruik van koud water moet de eerste spuit leeg blijven. Start de robot. Het supernatant in elke buis wordt opgezogen in de lege spuit en de tweede pomp voegt koud water toe aan de buizen.

Deze stap wordt uitgevoerd om alle niet-reagerende reagentia uit de nanodeeltjessuspensies te verwijderen. Homogeniseer vervolgens de nanodeeltjessuspensie door middel van sonicatie, zoals eerder gedemonstreerd. Centrifugeer de buisjes daarna bij 12,000 ×g gedurende vijf minuten.

Voer een tweede wasbeurt uit met koud water met behulp van het robotapparaat voor de tweede reactielading. Voeg 12 equivalenten per nanodeeltjesmonster EDC toe aan de eerste pomp en 12 equivalenten per nanodeeltjesmonster NHS aan de tweede pomp. Start het robotplatform om de juiste volumes te dispenseren in de buisjes met nanodeeltjes. De aanwezigheid van EDC en NHS maakt de vorming van een amidebinding mogelijk tussen de aminegroepen van het ethyleendiamine dat al aan het nanodeeltjesoppervlak is gebonden en de carbonzuurgroep van de diep beschermde suiker.

Zodra de depositie is voltooid, worden 10 equivalenten van een specifiek saccharide geladen. In dit geval werden lactose en de glycolzuurcontrole in de twee beschikbare pompen gebruikt. Elk saccharide wordt gedeponeerd in reageerbuisjes, afhankelijk van de gewenste functionalisatie per buisje; dit is vooraf geprogrammeerd in het LabVIEW-programma dat wordt gebruikt om de actuatoren en pompfuncties voor de specifieke reactie aan te sturen. Voor de koppeling van koolhydraten in deze studie wordt glycolzuur als linkercontrole gebruikt, aangezien diep beschermde sacchariden dit molecuul al covalent gebonden hebben, wat verdere koppeling aan het oppervlak van het nanodeeltje mogelijk maakt.

Nanodeeltjessuspensies worden zoals voorheen gehomogeniseerd door sonicatie en vervolgens negen uur geïncubeerd onder constante rotatie bij vier graden Celsius. Was na incubatie de nanodeeltjessuspensies door te centrifugeren en het supernatant te verwijderen, resuspendeer het pellet vervolgens in koud water en sonicate. Plaats de buisjes, die nu de functionele nanodeeltjesbibliotheek bevatten, in een vacuümkamer om gedurende ten minste twee uur te drogen. De gefunctionaliseerde nanodeeltjes worden gekarakteriseerd middels dynamische lichtverstrooiing en andere methoden om de oppervlaktesamenstelling, concentratie, deeltjesgrootte, grootteverdeling en oppervlaktelading te bepalen.

De hier getoonde volledig beschermde diano-zijde is gesynthetiseerd met behulp van het automatiseringsplatform. De gesynthetiseerde verbinding is gekarakteriseerd via protonen-NMR in een VXR 400 megahertz spectrometer. Met gebruik van CDC 13 als oplosmiddel kan de vorming van het product worden bevestigd aan de hand van enkele karakteristieke pieken.

In het proton-NMR-diagram zijn de vier protonen van 1,79 tot 2,21 en de twee protonen op 3,38 afkomstig van de florist-tag. De singletpiek op 2,16 komt overeen met de acetaatpiek; de pieken op 4,94 en 5,11 zijn de anomere protonen om het effect van de reactietijd op de uiteindelijke morfologie van de nanodeeltjes en de behaalde graad van suikerbinding te beoordelen. De nanodeeltjes werden gefunctionaliseerd met toenemende reactietijden zoals hier getoond; de concentratie diano op het oppervlak van 50 50 CPT CPH-nanodeeltjes nam toe met de totale reactietijd en bereikte een maximum na 18 uur.

Nanodeeltjes die gefunctionaliseerd waren met een totale reactietijd van 24 uur werden vervolgens gebruikt om hun vermogen om CLR's op dendritische cellen uit het beenmerg van muizen te targeten te evalueren middels flowcytometrie, zoals hier wordt getoond. Een verhoogde expressie van DC-sign en de mannose-receptor voor C-type lectine-receptoren werd waargenomen na stimulatie met zowel niet-gefunctionaliseerde als lactose- en mannose-gefunctionaliseerde nanodeeltjes. Dit wijst op een effectieve targeting.

Echter vertoonden Diano-gefunctionaliseerde deeltjes een hoger expressieniveau, wat duidt op een specificiteit van dit ligand voor de bestudeerde receptoren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het uitvoeren van de high-throughput geautomatiseerde synthese van oligosachariden, evenals de functionalisering van poly-nanodeeltjes. Door deze op koolhydraten gebaseerde targetingsmiddelen te gebruiken, kan, zodra de synthese van de donor-acceptor beschermde suikers is beheerst, de montage van de apparatuur in 24 tot 48 uur worden voltooid.

Natuurlijk is de tijdsduur afhankelijk van de grootte van de bibliotheek alsmede de functionalisatietijd. Bij het toepassen van deze methode is het belangrijk om te onthouden dat u de reactieomstandigheden voor de functionalisatie van biologisch afbreekbare poly-hydrodeeltjes kunt optimaliseren, afhankelijk van de chemie van de nanodeeltjes. Door deze procedure te volgen, kunnen verschillende koolhydraatstructuren worden gesynthetiseerd om verschillende celreceptoren te targeten om zo de immunologische uitkomst te beïnvloeden.