High Throughput Single-cel en Multiple-cel Micro-encapsulatie

Toepassingen die gebruikmaken van cellen ingesloten in kleine druppels van picoliterformaat werden vaak beperkt door het onvermogen om het aantal cellen per druppel te controleren. Dit protocol demonstreert een methode om celencapsulatie te beheersen door twee verschillende microfluïdische fenomenen te combineren: hydrodynamische celordening en druppelgeneratie bij een flow-focusing micronozzle. In een stroomopwaartse kanalensnede wordt een voldoende hoge stroomsnelheid van een waterige oplossing met gesuspendeerde cellen of deeltjes geleverd om de vorming van treinen met gelijke tussenruimtes in de stroomrichting stroomafwaarts te veroorzaken.

Een flow-focusing druppelgeneratie-nozzle wordt gebruikt om waterige druppels met kilohertz-frequenties te vormen in een surfactant-gestabiliseerde toelaatbare oliehoudende dragervloeistof. De geordende cel- of partikelreksen worden vervolgens gecombineerd met de druppelgeneratie door de waterige en olie-stroomsnelheden zodanig af te stemmen dat de druppelgeneratiesnelheden gesynchroniseerd zijn met de aankomst van longitudinaal geordende cellen of partikels bij de druppelgeneratie-nozzle, waarbij partikels als cel-surrogaten worden gebruikt. Om dit protocol te demonstreren moeten de stroomsnelheden voldoende laag zijn om de vloeistof te beperken.

Afschuifspanningen op biologische cellen, de overlap tussen de celordening, druppelgeneratie en cellevensvatbaarheid. Beperkingen in de waterige stroomsnelheid zorgen voor een ideaal operationeel regime voor gecontroleerde inkapseling van enkelvoudige en meervoudige cellen. Analyse van videomicroscopiedata laat zien dat zowel de inkapselingsefficiënties van enkele als dubbele cellen of deeltjes superieur zijn aan de efficiënties bij willekeurige inkapseling en het aantal druppels dat niet het gewenste aantal cellen of deeltjes bevat, aanzienlijk verminderen.

Het opsluiten van cellen en druppels beperkt de verdunning van celsecreties, brengt celheterogeniteit naar voren en reguleert tevens intercellulaire signalen in vergelijking met een bulk-suspensie. Efficiënte methoden om deze cellen in druppels in te kapselen, vormen een waardevol instrument voor biologisch onderzoekers om deze procedure te starten. Ontwerp een microkanaalpatroon zoals getoond in deze figuur in AutoCAD-software.

Het lange kanaalsectie vertegenwoordigt het waterige stroomordeningkanaal met een breedte van 27 microns. Het vergrote schema van de nozzle laat gelijke kanaalbreedtes van 27 microns zien voor het waterige ordeningskanaal en het oliekanaal, gevolgd door de nozzlevernauwing van 22 microns en een plotselinge expansie naar een breder kanaal van 61 microns. De hoogte van het apparaat is 52 microns.

Zowel de waterige als de olie-inlaaten zijn voorzien van grote debrisfilters met openingen in de orde van grootte van de breedte van het sorteerkanaal, zoals geïllustreerd in dit vergrote schema van de olie-inlaat. Hier is een werkelijke afbeelding van het sorteerkanaal en de nozzle, geïnjecteerd met kleurstof. Maak gebruik van een externe fabrikant om een transparantiemasker met hoge resolutie te printen op Mylar-folie of kwarts, waarbij de kanalen transparant zijn op een donkere achtergrond.

Maak vervolgens een master van silicium en SU-8 fotolak voor replica-gietvorming. Plak de mastervorm op de bodem van een Petrischaal voor de PDMS-replica-gietvorming. Nadat de replica-gietvorming is voltooid en de omtrek van het device is uitgesneden, gebruik dan een biopsietpons met een buitendiameter van 0,75 millimeter om vloeistofpoorten te ponsen in de drie ronde regio's die in deze figuur worden getoond; breng schilderstape aan op de patroonzijde van de PDMS en trek deze eraf om eventueel stof te verwijderen na plasma-bonding.

Het PDMS aan een schone glazen objectglas hechten. Plaats het gehele apparaat in een oven en verwarm de oven geleidelijk tot 120 °C. Laat het apparaat gedurende de nacht in de oven op 120 °C blijven om de binding te voltooien en het PDMS terug te brengen naar de oorspronkelijke hydrofobe toestand.

Een alternatieve methode om het glasoppervlak van het kanaal hydrofoob te maken, is door een coating zoals Aquapel in de vloeistofpoorten te injecteren en vervolgens met lucht te spoelen. Trek met een spuit van één milliliter en een spuitnaald enkele honderden µL lucht op, gevolgd door een kleine hoeveelheid Aquapel, net genoeg om alleen de metalen naaldpunt van de spuit te vullen. Injecteer de Aquapel en daarna de spoellucht voorzichtig, maar stevig, in de vloeistofpoorten. Doe dit zonder de binding tussen de PDMS en het glas agressief te verbreken.

Herhaal de luchtspoeling op alle inlaat- en uitlaatpoorten terwijl overtollig water wordt afgeveegd, om afzettingen te voorkomen die de kanalen bij het drogen kunnen verstoppen. Het beheersen van de celconcentratie is essentieel om het juiste aantal cellen per druppel te bereiken. Dit bestaat uit twee uitdagende componenten.

Ten eerste moet de juiste concentratie vooraf worden geschat, en ten tweede moet deze concentratie tijdens het experiment worden gehandhaafd. Voor het specifieke apparaat dat in deze studie is gebruikt, zouden cellen of partikels van 8 tot 15 micron adequaat moeten zijn voor gecontroleerde inkapseling. In deze demonstratie worden polysdiarymicrosferen van 9,9 micron gebruikt als cellsurrogaten. Om de concentratie van de waterige partikelsuspensie voor een ideale inkapseling voor te bereiden, wordt gestart met een voorraadconcentratie van de microsferen van 1% vaste stof op basis van gewicht, gebruikmakend van eerdere gegevens voor volledige ordening. Ter richtlijn: verhoog de concentratie naar 1,5% vaste stof door één milliliter van het voorraadmonster voorzichtig te centrifugeren, 250 microliter van de supernatantvloeistof te verwijderen en de partikels opnieuw te suspenderen door middel van vortexen of voorzichtig mengen.

Bij het gebruik van cellen hebben zowel de cellen als de polystyreendeeltjes een soortelijk gewicht groter dan één, hoewel dit niet in deze video wordt getoond. Voor langdurige experimenten met een tijdsduur van enkele minuten tot uren kan de oplossing drijfvermogens-geoptimaliseerd worden door een opgeloste stof toe te voegen, zoals calciumchloride voor deeltjes of OptiPrep voor cellen. Nadat de cel- of deeltjessuspensie gereed is, bereidt u een monster van 10 milliliter van de continue fluorcarbonolie-fase voor in een 15 milliliter centrifugebuis en mengt u deze met een vortex.

Meng het surfactant en de fluorcarbonolie tot een concentratie van ongeveer 2,5 gewichtsprocent. In dit geval verkrijgen we een mengsel van 2,4 gewichtsprocent, wat acceptabel is voor het opzetten van het micro-encapsulatie-experiment. Zet eerst de stroom van de omgekeerde optische microscoop en de hogesnelheidscamera aan.

Focus op de microkanaallaag en inspecteer de kanalen op verstoppingen en eventueel vuil dat los zou kunnen raken. Selecteer een kanaal dat vrij is van groot vuil of duidelijke verstoppingen. Snijd drie stukken doorschijnende tigon PVC-slang voor de waterinlaat, de olieinlaat en de emulsie-uitlaat om het dode volume te minimaliseren.

Knip precies genoeg slang af om de afstand van de spuitpompen naar de microscoop te overbruggen. Snijd de uiteinden van de slang onder een hoek van 45 graden af. Gebruik een pincet om de uiteinden van de slang in de vloeistofpoorten te drukken voor een eenvoudige invoering. Druk vervolgens een stompe roestvrijstalen spuitnaald van 30 gauge in het vrije uiteinde van de aqueous-inlaatslang.

Herhaal dit voor de olie-inlaattube. Verplaats het apparaat en bevestig de slang aan de objecttafel van de microscoop met een 20x objectief, lijn het uit en stel scherp op de spuitmond van het apparaat. Stel de microscoop handmatig in voor Köhler-verlichting om een optimale verlichting in het brandvlak te verkrijgen.

Gebruik de software van de hogesnelheidscamera om het beeldveld rond de spuitmond bij te snijden zodat hogere framerates mogelijk zijn, en stel vervolgens de framerate, de belichtingstijd en andere camerainstellingen in zoals vereist voor een optimale opname. Vul daarna een spuit van one milliliter met de eerder bereide, goed gemengde oplossing van de waterfase. Vul een spuit van drie milliliter met de olie-fase oplossing.

Houd een van de gevulde spuiten verticaal en tik ertegenaan om luchtbellen naar de uitlaat van de spuit te verplaatsen. Druk de zuiger langzaam ver genoeg in om de lucht naar de tip van de spuit te duwen, terwijl de spuit verticaal wordt vastgehouden. Verbind de spuit met de bijbehorende spuitnaald die reeds aan het apparaat is bevestigd.

Druk de zuiger in om de lucht door het dode volume van de spuitnaald te persen totdat de vloeistof door de slang bijna tot aan het apparaat is geduwd; bevestig de spuit stevig op een spuitenpomp en vergrendel het zuigerblok. Herhaal de koppelingen voor de tweede spuit en bevestig deze op een tweede spuitenpomp; zet elke spuitenpomp aan en programmeer elke pomp. Stel, conform de protocollen van de fabrikant, de initiële stroomsnelheden in op 50 microliters per minuut voor de oliefase en vijf microliters per minuut.

Voor de start van de waterige fase wachten de pompen tot elke vloeistof het apparaat binnengaat en de kanalen vult, waarbij resterende luchtbellen worden weggeduwd. Dit kan enkele minuten duren bij gebruik van de initiële stroomsnelheden. Observeer de vorming van druppels bij de spuitmond.

Verhoog langzaam de stroomsnelheid van de waterige fase om de ordening van deeltjes in het lange kanaal met de waterige oplossing waar te nemen. Terwijl de stroomsnelheid toeneemt, mag deze niet zo hoog worden dat er spuiting van de waterige vloeistofstroom aan de nozzle optreedt, zoals in dit voorbeeld wordt getoond; let op dat bij het gebruik van een andere nozzle voor druppelgeneratie hier een onstabiele stroming en inconsistente druppels ontstaan. Als de partikelconcentratie te laag is om alternerende reeksen met relatief weinig ontbrekende deeltjes te verkrijgen en het monster niet drijfvermogens-gematcht was, kantel dan de spuitenpomp fysiek richting de uitgang van de spuit om een geleidelijke bezinking van deeltjes naar de uitgangen van de spuit te bewerkstelligen.

Zodra er een adequate ordening optreedt, wordt de olie-stroomsnelheid aangepast om de generatiefrequentie en de grootte van de druppels af te stellen. Pas beide stroomsnelheden iteratief aan om de gewenste inkapselingspercentages en druppelvolumes te bereiken. Wanneer een stabiele geordende inkapseling is bevestigd, wordt de uitlaatslang vanuit het afvalreservoir naar een opvangreservoir verplaatst voor toekomstig gebruik.

Enkelvoudige en meervoudige inkapseling van deeltjes of cellen kan met een hoge efficiëntie worden bereikt. Bij gebruik van dit protocol wordt hier een representatief resultaat getoond van enkelvoudige partikelinkapseling met een oliesnelheid van 60 µL/min en een waterige stroomsnelheid van negen µL/min. Lambda, het gemiddelde aantal deeltjes per druppel, is 0,95.

De tussenruimte tussen deeltjes in de stroomrichting is ongeveer 17 tot 18 microns voor volledig geordende alternerende deeltjes. De druppelgeneratiesnelheid in dit voorbeeld is 6,1 kilohertz met een gemiddelde druppelgrootte van 24,4 picoliters. Het histogram vergelijkt de efficiëntie van deeltjesinkapseling in druppels bij enkelvoudige deeltjesinkapseling met plus.

Wat betreft de statistiek: bij een willekeurige inkapseling voor een steekproefgrootte van 517 druppels is de gemiddelde fractie druppels die één partikel bevatten 79,5%, tegenover een voorspelde fractie voor willekeurige inkapseling van 36,7%. De fractie partikels die terechtkwamen in de correct ingekapselde druppels bleek 83,7% te zijn voor een steekproefgrootte van 491 partikels, terwijl de fractie voor willekeurige inkapseling 37,3% was. Inkapseling van dubbele partikels wordt eenvoudig bereikt door de oliedoorstroomsnelheid te verlagen naar 30 µL per minuut, terwijl de waterige doorstroomsnelheid op negen µL per minuut wordt gehouden. Hier is lambda, het gemiddelde aantal partikels per druppel, 1,8. Dit is vergelijkbaar met inkapseling van enkele partikels.

De afstand tussen deeltjes in de vloeirichting is ongeveer 17 tot 18 micron voor volledig geordende alternerende deeltjes. De grotere druppels hebben een gemiddelde druppelgrootte van 39,8 picoliters en zijn gevormd met een frequentie van 3,8 kilohertz vergeleken met willekeurige inkapseling. Voor een steekproefomvang van 383 druppels is de gemiddelde fractie geordende inkapselingsdruppels die twee deeltjes bevatten 71,5%, tegenover een voorspelde willekeurige inkapselingsfractie van 26,8%. De fractie deeltjes die in de correct ingekapselde druppels terechtkwamen, bleek 79,5% te zijn voor een steekproefomvang van 689 deeltjes, terwijl de willekeurige inkapselingsfractie 33,4% bedroeg.

Samen laten deze resultaten zien dat zowel de inkapselingsefficiënties voor enkele als dubbele deeltjes meer dan een factor twee beter zijn dan de willekeurige inkapselingsefficiënties en het aantal druppels dat niet het gewenste aantal cellen of deeltjes bevat, aanzienlijk verminderen. Het belang van juiste deeltjes- of celconcentraties voor een hoge inkapselingsefficiëntie wordt in deze experimentele run geïllustreerd. Hoewel de debieten van de olie- en waterfase gelijk zijn aan die in de eerder getoonde run voor dubbele deeltjesinkapseling, is het gemiddelde aantal cellen per druppel lambda verlaagd tot 1,57.

Bijgevolg vindt er geen volledige ordening plaats, waardoor er gaten in de treinen ontstaan en zonne-druppels overblijven met minder particles dan verwacht. Dit histogram toont de verminderde efficiëntie voor inkapseling van twee particles als gevolg van de lagere waarde van Lambda. Voor een steekproefomvang van 324 druppels was de gemiddelde fractie druppels die twee particles bevatten 55,9%, waarbij bijna net zoveel druppels met één particle als druppels met twee particles voorkwamen.

Dit geeft aan dat Lambda gelijk aan of dicht bij het gewenste aantal cellen per druppel moet liggen om het aantal correct ingekapselde deeltjes of cellen te maximaliseren, waarbij de exacte waarde van lambda wordt gekozen afhankelijk van of een lager of hoger aantal cellen per druppel toelaatbaar is. In deze demonstratie maken we gebruik van verschillen in drijfvermogen om real-time controle over de concentratie tijdens het experiment mogelijk te maken. Voor langdurige experimenten kan het echter raadzaam zijn om het drijfvermogen gelijk te trekken voor consistentere resultaten na de inkapseling van cellen in waterige druppels.

Tijdsafhankelijke experimenten kunnen worden uitgevoerd in een centrifugebuis of onder een microscoop door de druppels opnieuw in microfluïdische arrays te injecteren.