Combinatoriële Synthese van en high-throughput eiwit Op de markt van Polymer Film en Nanodeeltje bibliotheken

Deze video beschrijft de combinatorische synthese van bibliotheken met biologisch afbreekbare polyanhydride-folies en nanodeeltjes, en de high-throughput detectie van eiwitvrijgave uit deze bibliotheken. Eerst wordt een geautomatiseerd high-throughput depositieapparaat gebruikt om een compositioneel diverse reeks monomeren in glazen cuvetten aan te brengen. Een polycondensatiereactie wordt uitgevoerd bij 180 °C en 0,3 tor gedurende 1,5 uur.

Deze reactiecondities zijn specifiek voor de synthese van C-P-H-S-A polyanhydridepolymeren. Met behulp van het geautomatiseerde depositieapparaat worden het oplosmiddel en eventuele componenten voor inkapseling in de cuvetten gedeponeerd die de polymeerbibliotheek bevatten. Sonicatie kan worden toegepast om volledige oplossing van het polymeer en een uniforme verspreiding van de additionele componenten te waarborgen.

Vervolgens wordt het opgeloste polymeer overgebracht naar een buis met nonsolvent om de nanodeeltjesbibliotheek via nanoprecipitatie te vervaardigen. De nanodeeltjes worden teruggewonnen door vacuümdrogen of filtratie en daarna overgebracht naar een gemodificeerde 96-wells releaseplaat. Ten slotte wordt de eiwitgeladen bibliotheek onder fysiologische omstandigheden geïncubeerd en worden de eiwitvrijgavekinetieken geëvalueerd met behulp van een fluorescentiedetectiemethode.

Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de kinetiek van eiwitvrijgave tonen als functie van de polymeereigenschappen of de omgevingscondities van de vrijgave. Het belangrijkste voordeel van deze benadering ten opzichte van andere conventionele technieken waarbij één monster tegelijk wordt geanalyseerd, is dat we in staat zijn om meerdere monsters gelijktijdig te synthetiseren. Deze monsters kunnen vervolgens via high-throughput screening worden onderzocht op interacties tussen eiwit-polymeer, cel-polymeer of gastheer-polymeer.

Dit versnelt vervolgens het rationele ontwerp en de ontwikkeling van deze biomaterialen voor geneesmiddelentoediening en weefseltechnologie. De procedure zal worden gedemonstreerd door La Tricia Peterson, een postdoc uit mijn laboratorium. In dit gedeelte van de video wordt een high-throughput depositieapparaat gebruikt om een compositioneel variërende monomeerbibliotheek te deposeren na de polymeersynthese.

Dit apparaat wordt gebruikt voor het vervaardigen van een combinatorische bibliotheek van blanco of met eiwitten geladen polymeerfilms of nanodeeltjes. Het geautomatiseerde platform bestaat uit twee programmeerbare spuitenpompen en drie lineaire actuatoren die in serie zijn verbonden met een computer. LabVIEW-software wordt gebruikt om commando's naar de spuitenpompen en actuatoren te sturen.

10 cc gasttight spuiten worden geplaatst in spuitpompen met metalen capillaire buizen die zijn aangesloten via lure lock-koppelingen, waarmee de polymeeroplossingen in glazen cuvetten worden gedoseerd. In deze demonstratie worden seic acid of SA en one six Biss para oxy heane of CPH gebruikt om een bibliotheek van nanodeeltjes te maken die Texas Red Boan serum albumine inkapselen. De instructies in deze video en de bijbehorende documenten kunnen worden aangepast om een breed scala aan polymeerfilm- en nanodeeltjesbibliotheken te vervaardigen en te testen.

Om de bibliotheken te synthetiseren, begint u met het oplossen van elk monomeer in chloroform tot een uiteindelijke concentratie van 25 milligram per milliliter in een glazen vial. Laad vervolgens elke oplossing in een gastichte spuit van 10 cc door de oplossing via het luer-lock-uiteinde van de spuit op te zuigen. Verwijder eventuele luchtbellen.

Bevestig vervolgens de oplosmiddelbestendige Luer-lock roestvrijstalen capillaire buis aan het uiteinde van de spuit. Zet de capillaire buizen vast in klemmen en bevestig deze aan een statief. Plaats vervolgens het uiteinde van beide capillaire buizen in de startcuvet.

Voor de depositie van monomeren. Plaats de spuiten op de programmeerbare spuitpompen en vergrendel ze in de juiste positie in de LabVIEW-software. Stel de lineaire actuatoren in de software in op de beginpositie.

Start de geautomatiseerde depositie van de SA- en CPH-monomeren in de glazen cuvetten langs de x-, y- en z-as. Actuatoren positioneren de capillaire buisjes correct in elke cuvet en pompen de geprogrammeerde volumes van elk monomeer erin, waardoor een compositioneel variërende monomeerbibliotheek wordt gecreëerd. Na de depositie van de monomeren.

Breng de monomeerbibliotheek over naar een voorverwarmde vacuümoven en incubeer deze bij 180 °C en 0,3 tour gedurende 1,5 uur om condensatiepolymerisatie mogelijk te maken. Na de incubatie is de vervaardiging van de polymeerbibliotheek voltooid. Vervolgens worden polymeernanodeeltjes geladen met eiwitten gegenereerd.

Raadpleeg het bijbehorende protocol voor de vervaardiging van een proteïneladen polymeerfilmbibliotheek voor het vervaardigen van een proteïneladen nanodeeltjesbibliotheek. Voeg in dit geval het eiwit, Texas red runderserumalbumine, toe aan het geschikte oplosmiddel, dat in staat moet zijn de polymeerbibliotheek op te lossen. Hier wordt methyleenchloride gebruikt in een concentratie van twee milligram per milliliter.

Vul de 10 cc spuit met Texas Red BSA-houdend oplosmiddel en plaats deze in de eerste spuitpomp. Plaats vervolgens een schone, lege spuit van twee cc in de tweede spuitpomp en plaats buisjes met 15 milliliters van een niet-oplosmiddel, in dit geval pentaan, in de buishouder naast het vialsplatform. Start vervolgens in de lab-view software het geautomatiseerde proces voor oplosmiddeldepositie door het programma te selecteren.

Na het starten van het programma wordt het oplosmiddel in de cuvetten met de polymeerbibliotheek gedoseerd, wat resulteert in een polymeerconcentratie van 20 mg/mL. Wanneer al het oplosmiddel is gedoseerd, laat het polymeer dan één tot vijf minuten oplossen. Volg dit eventueel op met agitatie om een volledige polymeeroplossing en een uniforme eiwitverspreiding te waarborgen.

Start vervolgens het programma voor monstertransport in LabVIEW. Elk opgelost polymeermonster in de bibliotheek wordt vervolgens in de lege spuit opgenomen en gedoseerd in de overeenkomstige buis met niet-oplosmiddel in de monsterhouder. Zodra elk monster is overgebracht, worden de eiwitgeladen nanodeeltjes teruggewonnen door de nanodeeltjesbibliotheek in een vacuümkamer bij een vacuüm van 10 millimeters kwik te plaatsen, of door vacuümfiltratie toe te passen totdat het oplosmiddel is verwijderd.

Om de afgifte van ingekapseld BSA te onderzoeken, begint u met een diepe 96-well polypropyleenplaat die is aangepast door de bovenste halve inch van de wand van elke well van om en om aangrenzende kolommen in de plaat te verwijderen. Het verwijderen van de bovenkant van elke well tussen kolommen A en B, C en D, E en F, en G en H maakt vloeistofstroom tussen elk paar aangrenzende wells mogelijk wanneer deze tot het volledige overdrachtsvolume zijn gevuld. Voeg Texas red BSA-standaarden variërend van 1000 tot 10 microgram per milliliter toe aan de diepe 96-well plaat.

Deze zullen worden gebruikt voor het berekenen van de eiwithoeveelheid en zullen ook rekening houden met fluorochroom-quenching. Reconstitueer de gewenste massa nanodeeltjes in PBS-buffer en sonicize vervolgens om de deeltjes gelijkmatig te verspreiden. Breng daarna de nanodeeltjesbibliotheek over naar de diepe 96-wellplaat en wacht tot de monsters naar de bodem van de wellplaat zijn gezakt. Vul vervolgens, met behulp van een pipetteerder, langzaam alle aangrenzende wells met PBS-buffer tot ongeveer een kwart inch vanaf de bovenkant van de well.

Er moet voldoende buffer in de aangrenzende putjes aanwezig zijn zodat deze vrij tussen de putjes kan stromen. Sluit vervolgens de releaseplaat af met het deksel en plaats deze bij 37 °C onder agitatie. Gebruik gedurende het experiment op opeenvolgende tijdstippen een 9, 400 Typhoon flatbed fluorescentiescanner om de plaat te scannen met behulp van de juiste excitatie-, laser- en emissiefilters.

Gebruik na het scannen software voor beeldkwantificering om de hoeveelheid vrijgekomen fluorochroom-geconjugeerd eiwit in elke release te kwantificeren. Texas Red BSA werd ingekapseld in een bibliotheek van polymere nanodeeltjes, gesynthetiseerd uit SA- en CPH-monomeren zoals beschreven in deze video, om de eiwitvrijgavekinetiek als functie van de polymeerchemie te bepalen. De eiwitgeladen nanodeeltjes werden één maand lang geïncubeerd bij 37 °C, waarbij op opeenvolgende tijdstippen fluorescentiescans werden uitgevoerd voor de kwantificering van de eiwitvrijgave.

Zoals hier wordt aangetoond, is deze methode voor hydro-doorvoer gebruikt om de afgiftekinetiek van Texas Red BSA te bepalen uit een A-C-P-H-S-A polyanhydride nanodeeltjesbibliotheek. Er werden chemie-afhankelijke trends waargenomen, met toenemende afgiftesnelheden bij Sarich-filmchemieën. Vergelijkbare resultaten werden verkregen bij het gebruik van standaard assays voor eiwitkwantificatie.

In een apart experiment werd de afgifte van Texas Red BSA uit CPT CPH polyanhydride-filmbibliotheken beoordeeld; zoals hier wordt getoond, werden kinetieken van nagenoeg nulde-orde afgifte waargenomen, waarbij cpeg-rijke films het eiwit het snelst afgaven, met potentiële toepassingen in het medische veld als biologisch afbreekbare apparaten voor geneesmiddelentoediening. Deze resultaten geven aan dat het gewenste afgifteprofiel van een therapeutisch geneesmiddel of vaccineantigeen kan worden beheerst door de polymeerchemie te wijzigen. Na deze procedure zijn andere combinatorische methoden ontwikkeld om gebieden zoals eiwitstabiliteit, cellulaire toxiciteit, cellulaire activatie en in vivo biodistributie te onderzoeken.

Deze aspecten zijn belangrijk voor het rationele ontwerp van biomaterialen voor geneesmiddelentoediening en tissue engineering. Vergeet niet om geschikte PBM te dragen en veilige laboratoriumprocedures toe te passen gedurende het gehele protocol.