Polymerase Chain Reaction: Basis Protocol Plus Problemen oplossen en Optimalisatie Strategieën

Het algemene doel van deze procedure is om de stappen te demonstreren die betrokken zijn bij de polymerasekettenreactie of PCR, die wordt gebruikt om een ruime hoeveelheid van een specifiek DNA-segment te produceren vanuit een kleine hoeveelheid startmateriaal. Verzamel eerst de reagentia en materialen die in de PCR-reactie worden gebruikt, stel vervolgens het reactiemengsel samen, inclusief de vier deoxyribonucleotiden, de DNA-template, de primers en het DNA-polymerase. Programmeer daarna de thermische cyclusingcondities en voer de PCR-reactie uit.

Doe daarna dit. Controleer de resultaten om vast te stellen of de reactie succesvol was. Uiteindelijk zou een polymeraseketenreactie een specifiek amplicon van de gewenste productgrootte moeten opleveren.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met dit protocol enige moeite hebben met het opzetten van de berekeningen voor elk van de variabele reagentia; soms treden er problemen op bij het pipetteren van de juiste volumes, met name bij de polymerase die glycerol bevat. Begin het experiment met een vers gevulde ijsbak. Draag handschoenen om contaminatie van de reactie te voorkomen.

Mengsel en reagentia. Plaats de PCR-componenten op ijs om ze volledig te laten ontdooien. Deze omvatten de DNA-templatprimers, DNA-polymerase, 10 x reactiebuffer met of zonder magnesiumchloride, deodoribonucleotiden, steriel water en magnesiumchloride.

Magnesiumchloride is vereist indien de buffer zonder magnesiumchloride wordt gebruikt. Plaats een 96-well plaat in een ijsbak als houder voor de 0,2 milliliter dunwandige PCR-buisjes. Voorzie de werkbank nu van PCR-buisjes en dopjes.

Een PCR-buisjesrek, een ethanolbestendige marker en een set micropipetten. Stel altijd een tabel met reagentia op waarin het reactiemengsel gedetailleerd wordt beschreven, waarbij gebruik wordt gemaakt van steriel gedestilleerd water om een eindvolume van 50 µL te verkrijgen. Gebruik bijvoorbeeld vijf µL van een buffer zonder magnesium, één µL van 10 mM dNTP's en een geoptimaliseerde concentratie van 4,0 mM magnesium.

Eén µL van elke 20 µM primer, 0,5 µL van een template van 2 ng/µL en 0,5 µL polymerase vereisen 33 µL steriel water. Voeg magnesiumchloride toe indien dit niet aanwezig is in de 10x buffer of indien dit nodig is voor de optimalisatie van de PCR.

Label de PCR-buisjes voor elke reactie met een ethanolbestendige marker. Voeg vervolgens de berekende hoeveelheden steriel water toe, gevolgd door 10 x buffer en 10 millimolar DN NTPs. Voor deze reactie voeren we een titratie uit met magnesiumchloride.

Omdat de magnesiumconcentratie niet constant zal zijn, wordt magnesiumchloride individueel aan de PCR-buisjes toegevoegd en wordt het volume aangevuld tot 10 µL met steriel water, zodat 40 µL van de uiteindelijke mastermix aan elk PCR-buisje wordt toegevoegd. Om de reactie van 50 µL en het magnesiumchloride te voltooien, worden vervolgens het DNA-template en de primers toegevoegd. Voeg tenslotte 0,5 tot 2,5 units DNA-polymerase per reactie van 50 µL toe in een microcentrifugebuisje van 1,8 mL.

Bereid een mastermix-oplossing die voldoende is voor de controles en het pipetteerverlies. Stel een micropipet in op ongeveer de helft van het totale oplossingsvolume en meng voorzichtig door te pipetteren. Pipetteer voor elk testmonster de mastermix in een PCR-buis.

Voeg voor de negatieve controle zonder template-DNA alle reagentia toe en gebruik steriel water om het ontbrekende DNA-volume te compenseren. Gebruik voor de positieve controle vervolgens een set template-DNA en primers die een bekend fragment amplificeren onder dezelfde condities als de experimentele PCR-monsters. PCR-thermocyclers verhitten en koelen het reactiemengsel snel, waardoor hitte-geïnduceerde denaturatie van de duplex, annealing van primers aan de plus- en minstrengen van het DNA-template en elongatie van het PCR-product mogelijk worden.

De cyclustijden zijn voor de algemene formule gebaseerd op de grootte van het template en het GC-gehalte van het DNA. Begin met een initiële denaturatie van het template en start vervolgens 25 tot 35 rondes van een driestaps temperatuurcyclusprogramma. De eerste stap van deze cycli dient om het DNA-template te denatureren.

Programmeer vervolgens voor het optimum een annealing van de primers op ongeveer vijf graden Celsius onder de schijnbare smelttemperatuur van de primers, gevolgd door de elongatiestap om de polymerase naar het DNA-sjabloon te brengen en het PCR-product te synthetiseren. Voer nu het aantal cycli in. Programmeer vervolgens.

Een verlengde elongatiestap voor de voltooiing van de synthese van amplicons. Voeg ten slotte een terminatiestap toe door het mengsel af te koelen tot vier graden Celsius. Als standaard PCR-condities niet het gewenste amplicon opleveren, is PCR-optimalisatie noodzakelijk om betere resultaten te behalen.

Als de reacties de eerste keer niet zijn geslaagd, is het raadzaam om de reactie te analyseren om de fout te vinden. Controleer daarom eerst of het probleem niet is veroorzaakt door een menselijke fout. Dit kan gebeuren bij een pipetteerfout of als u bent vergeten een reagens aan een van de reageerbuizen toe te voegen.

Vervolgens kunt u proberen enkele van de stringentie-instellingen van de condities aan te passen om de instellingen van de thermocycler te wijzigen, of u kunt de magnesiumconcentratie aanpassen als alternatieve methode. U kunt ook proberen additieven aan het reagens toe te voegen om problemen op te lossen. Overweeg alternatief hot start PCR als een veelzijdige modificatie waarbij de initiële denaturatietijd drastisch wordt verlengd.

Vervolgens wordt agarosegelelektroforese gebruikt om de PCR van het GAL3-gen uit genomisch DNA van S. seia te scheiden om de optimale magnesiumionconcentratie voor deze set reagentia te bepalen; let op, een PCR-product van de verwachte grootte van 2098 basenparen verschijnt vanaf een magnesiumconcentratie van 2,5 millimolair, met een optimale concentratie van vier millimolair. Bij amplificatie van het gewenste PCR-product op verschillende DNA-templates als een discrete band is 2 millimolair magnesium vereist. Het verlagen van de stringentie van de reactie naar effectief suboptimale amplificatiecondities resulteert in een smear van aspecifieke producten.

Bovendien is, bij een algemene vermindering van de strengheid van de reactie, een lagere hoeveelheid magnesiumionen vereist om een amplicon te vormen. Het optimaliseren van de PCR met inachtneming van de variabelen kan dus het specifieke gewenste product opleveren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een polymerasekettingreactie opzet en voorbereidt.

Het doel is om de variabelen van elke PCR te begrijpen en hoe deze kunnen worden gemanipuleerd om het gewenste amplicon te creëren.