Multiplexed fluorometrische Immunoassay Methodiek en problemen oplossen

Het algemene doel van het volgende experiment is het detecteren van antilichamen tegen adventieus infectieuze agentia in laboratoriumdieren. Dit wordt bereikt door testserum te incuberen met antigeen-gecoate microsferen. Vervolgens wordt het serum geïncubeerd met een biotinyleerde, soortspecifieke anti-immunoglobuline, die eventuele antigeen-antilichaam-immuuncomplexen detecteert.

Vervolgens wordt een streptavidine-gelabelde FICO eryn Fluor force-oplossing toegevoegd om eventuele gebiotinyleerde immunoglobulinen te detecteren. De verkregen resultaten tonen een positieve of negatieve antilichaamstatus aan voor veelvoorkomende agentia in laboratoriumknagers, gebaseerd op multiplex fluorescentie, de netto score van de immunoassay en fluorescente monsterwaarden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals ELISA, is dat MFIA een multiplex assay is. Hierdoor kan een onderzoeker tot honderd verschillende assays in één enkele test screenen.

Deze techniek vermindert de hoeveelheid serumregio's en wegwerpmaterialen die in de bestaande methoden worden gebruikt, terwijl de hoeveelheid informatie die uit één test wordt gegenereerd, wordt verhoogd. We kregen voor het eerst het idee om deze methode te gebruiken toen we een groot aantal serummonsters testten op meerdere agentia en de arbeid en de testtijd wilden verminderen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Donna Cohen, een senior technoloog uit ons laboratorium. Zorg bij aanvang dat de twee buffers die nodig zijn voor de multiplex fluorescentie-immunoassay (MFIA)-procedure klaarstaan.

De eerste is een primair verdunningsmiddel, verkrijgbaar bij Charles River, dat eigen blokkeringsmiddelen bevat om aspecifieke interacties voor de wasbuffer van de assay te verminderen. Bereid een PBS-oplossing met 1% BSA pH 7,4 om particulatele resten te verwijderen. Filtreer de buffer door een 0,2 micron bottle top unit in steriele, gelabelde containers met gebruik van de assay wasbuffer.

Bereid twee x concentraties voor van gebiotineerde antispecies, IgG of BAG, en strep avidine en FICO-erytrocyten of SPE, die worden gebruikt om de antigeen-antilichaamcomplexen die tijdens de incubatiestap van het testserum zijn gevormd te labelen. Bereid monsters van de volgende materialen en wegwerpartikelen: geassembleerde multi- en enkelkanaals micropipetten en tips, en 96-wells microtiterplaten met lage eiwitbinding voor eiwitverdunning. Na het verzamelen van bloedmonsters en het isoleren van serum wordt het serum kort gevortext voordat de monsters in primaire verdunningsvloeistof in een 96-wells microtiterplaat worden verdund om een juiste en uniforme vulling van de wells te garanderen. Voorbevochtig elke well van de 96-wells testplaat met assay-wasbuffer en aspireer de oplossing gedurende de gehele assay langzaam.

De aspiratie moet vijf tot 10 seconden duren om aggregatie van beads en het samendrukken van beads in het filtermembraan te voorkomen; beide kunnen de leestijden aan het einde van de assay vertragen. Controleer of de vloeistofafvoer is gestopt door de onderkant van de testplaat af te drogen met papieren handdoeken. Het is belangrijk om de testplaat na elke wasstap af te drogen om het uitknipperen van vloeistof uit de putjes tijdens de incubatie te voorkomen.

Om de beads voor te bereiden, begint u met het vortexen van de stock-suspensie van de gekoppelde beads. Soniceren ze vervolgens kort in een bad. Het is cruciaal om de beads correct te resuspenderen om geaggregeerde bead-clusters te voorkomen, wat kan leiden tot langere leestijden.

Dispenseer vervolgens de 20 x voorraadsuspensie in een twee x werkoplossing van beads in primaire verdunningsvloeistof. Dispenseer daarna 50 µL van de twee x bead-suspensie in elke assay-put van de vooraf bevochtigde testplaat. Pipetteer 50 µL van elk twee x test- en controleserum op de testplaat op basis van een vooraf gedefinieerde plaatkaart.

Sluit het deksel van de plaat stevig. Dek deze af met aluminiumfolie en incubeer de testplaat gedurende 60 minuten op een orbitale schudmachine bij kamertemperatuur om verdamping van de oplossingen te voorkomen, wat het succes van de assay in gevaar kan brengen. Houd de testplaat tijdens alle incubatiestappen afgedekt met het plaatdeksel.

Bovendien moet de schudsnelheid groter zijn dan 400, maar minder dan 700 RPM, zodat de beads in suspensie blijven en de serumantilichamen toegang hebben tot alle oppervlakken van de gekoppelde antigenen. Nadat de plaat is gewassen in opeenvolgende incubaties van de beads met BAG en SPE, moeten de monsters opnieuw worden gewassen. Resuspendeer daarna de beads door 125 µL assay-wasbuffer toe te voegen en schud gedurende twee minuten voordat de plaat wordt afgelezen.

Plaats het binnen 10 minuten na het resuspenderen van de beads in de assayreader; de beads passeren één voor één een detector waarbij ze worden blootgesteld aan twee lasers. Eén laser exciteert de interne kleurstoffen die de kleurset van de beads identificeren en de andere exciteert de FICO erything reporterkleurstof. De intensiteit van de FICO erything fluorescentie voor een vooraf bepaald aantal beads wordt gerapporteerd als de FM FI; lees de eerste put uit om te verifiëren dat het geselecteerde bead-panel overeenkomt met het bead-profiel in de testputten.

Als er kralen buiten hun aangewezen kralengebied op het protocolscherm vallen, is er een onjuiste profielselectie gemaakt. Kralen die correct zijn geresuspendeerd, zullen hun gespecificeerde gebieden vullen zoals aangegeven in de software van de assay-lezer. Als de kralen geaggregeerd zijn, zullen ze hun gebieden in een langzaam tempo vullen.

U kunt de testplaat uit de reader halen en de wells handmatig resuspenderen om de beads te scheiden. Verwijder de testplaat uit de reader en pipetteer elke well drie tot vier keer met een multichannel pipet. Plaats de testplaat vervolgens terug in de reader en ga verder met het analyseren van de resultaten.

Meld fouten zoals onvoldoende kraalentellingen of dalende IgG anti-IgG kraalscores, en herhaal de assay voor deze monsters. Nadat de gegevens naar Excel zijn geëxporteerd en de netto MFI is berekend, moet worden bepaald of er assay-controles van de test zijn mislukt, met uitzondering van het immuunserum met hoog bereik. Eventuele mislukte controles zijn onaanvaardbaar en de assay moet worden herhaald.

Deze tabel bevat gegevens van testserum en assay-controles van een typische assayplaat. Alle IgG-controles waren geslaagd. De testresultaten voor deze plaat geven aan dat talrijke weefselreactieve monsters en IgG-controlemonsters niet zijn geslaagd, zoals te zien is in de oranje wells.

A1C een en F1 duiden op een reactief falen van TC-weefsel waarbij de TC-score tussen haakjes wordt weergegeven; Wells B een en E een illustreren de twee typen falen van de IgG-interne controle, respectievelijk onvoldoende testantilichaam of testreagentia, BAG of SPE. De resultaten van de testplaat worden alleen geïnterpreteerd als de systeemgeschiktheidscontrole en de serumcontrole voldoen aan de hier getoonde acceptatiecriteria. Microsferen gecoat met soortspecifiek anti-testserumimmunoglobuline kunnen falende scores vertonen door de toevoeging van een onvoldoende monster, een te hoge monsterverdunning, een onjuiste soort, of testserum van een immuundeficiënte gastheer.

Indien de resultaten van de test-assay-controle bevredigend zijn, worden de individuele assay-scores als volgt geclassificeerd. Na deze procedure dienen aanvullende methoden zoals Eliza, IFA en/of Western blot te worden gebruikt om de initiële onverwachte of positieve bevindingen te bevestigen. Het is cruciaal om deze resultaten te verifiëren voordat er beslissingen worden genomen over het beheer van de dieren.

Dit kan worden gedaan door verschillende methodologieën toe te passen op hetzelfde monster of op aanvullende monsters van dezelfde kolonie. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de multiplex fluoro-metrische immunoassay uitvoert en hoe u de in uw faciliteit behaalde resultaten interpreteert. Dit stelt u in staat om de arbeid te verminderen terwijl u meer informatie verzamelt uit elke testmonsterput.