Analyse van de pulmonale dendritische cel maturatie en migratie tijdens de allergische luchtwegontsteking

Het doel van deze procedure is om de rijping en migratie van pulmonale dendritische cellen of DC's te beoordelen tijdens het verloop van Val Boomin-geïnduceerde allergische luchtweginflammatie bij muizen. Dit wordt bereikt door de muizen eerst te sensibiliseren met Val Boomin, gevolgd door een luchtwegchallenge met fitsy-gelabeld Val Boomin. Vervolgens worden de long en de mediastinale lymfeklieren geoogst.

Ten slotte wordt een enkelcel-suspensie bereid van de long- en lymfeknoopprocessen. Uiteindelijk kunnen de rijpingsstatus en het absolute celgetal van de pulmonale dendritische cellen die in de mediastinale lymfeknooppunten worden aangetroffen na FITC Val Boomin challenge, worden bepaald via flowcytometrische analyse. Deze methode kan ons helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen over pulmonale immuunresponsen, zoals of dendritische cellen rijpen na blootstelling aan antigenen en of ze migreren naar de drainerende lymfeknooppunten.

En indien ze migreren, wat dan de migratiesnelheid is. Begin met het druppelsgewijs toevoegen van vers bereide Val Boomin-oplossing in een verhouding van één-op-één aan een buisje alum terwijl u vortex t. Roer het mengsel 30 minuten lang en vul vervolgens een spuit van 1 ml met 0,2 ml van het mengsel.

Pak de te injecteren muis vast bij de nekvel, vlakbij de basis van de schedel, met de duim en wijsvinger van één hand. Injecteer vervolgens met de andere hand de Val Boomin alum-oplossing in de peritoneale holte van de muis. Zeven dagen na de tweede injectie van Val in alum wordt een geanestheseerd, met val in alum gesensitiseerd dier rechtop gehouden, waarna met steriele pipetpunten 100 µL van een vers bereide val in fxi-oplossing druppelsgewijs op de NAS van de muis wordt gepipetteerd.

Begin met het bevestigen van een katheter van 20 gauge aan een spuit van één milliliter. Open vervolgens, na bevestiging van de euthanasie van de muis, de borstholte van het dier tot aan de nek om de trachea van de muis bloot te leggen en te canuleren. Het is absoluut cruciaal om de longen te spoelen en het hart te perfunderen om er zeker van te zijn dat alle contaminerende alveolaire macrofagen en mononucleaire cellen die in het perifere bloed aanwezig zijn, zijn verwijderd.

Zorg ervoor dat u de volgende twee stappen zorgvuldig en uiteraard met een vaste hand uitvoert. Dien nu drie keer ijskoud PBS met EDTA toe via de katheter om de onderste luchtwegen te spoelen en cellen uit de alveolaire ruimtes te verwijderen. Monteer vervolgens een naald van 20 gauge op een spuit van 10 milliliter en perfundeer de longen met 10 milliliters PBS met heparine via de rechterventrikel van het hart.

De verwijdering van alle resterende bloedcellen uit de longvasculatuur wordt als voltooid beschouwd wanneer de longen wit kleuren. Verwijder vervolgens de mediastinale lymfeklieren en plaats deze in een apart schaaltje. Voorkom quenching van FITC door de blootstelling van het weefsel aan licht te minimaliseren.

Dissect vervolgens de geperfuseerde longen en plaats deze in een Petrischaal; versnipper de longen met een schaar. Verteer daarna het longweefsel bij 37 °C in 250 units per milliliter collagenase D. Voeg na 25 minuten incubatie gedurende vijf minuten EDTA toe aan het mengsel om de collagenase-activiteit te stoppen. Breng tot slot de fragmenten van de verteerde longen door een celzeef van 100 micron en lyseer de erytrocyten met een hypotone buffer.

Scheid de mediastinale lymfeklieren met fijne naalden en verteer deze met collagenase, zoals zojuist gedemonstreerd voor de longen, gevolgd door het zeven van het weefsel door een celzeef na intraperitoneale sensibilisatie en luchtweguitdaging. De aanwezigheid van ontstekingscellen kan worden geëvalueerd door hematoxyline- en eosinekleuring in representatieve longsecties van de controlegroep.

Bij dieren behandeld met zoutoplossing zijn de weefsels vrij van ontsteking, zoals aangetoond in de bovenste afbeelding. In tegenstelling hiermee zijn ontstekingscellen wijdverspreid in de longcoupes van Val bij gesensitiseerde en uitgedaagde dieren, zoals te zien is in de onderste afbeelding. Een periodaat-Schiff-kleuring kan worden gebruikt om de slijmproductie te beoordelen, zoals getoond in deze onderste afbeelding.

De inductie van allergische ontsteking van de luchtwegen na uitdaging met val in gesensitiseerde muizen wordt bevestigd door de aanwezigheid van slijm. Omgekeerd vertonen controlemuizen die met zoutoplossing zijn behandeld een volledige afwezigheid van slijmproductie, zoals aangetoond in de bovenste afbeelding; na uitdaging met val ondergaan pulmonale dcs rijping en daaropvolgende migratie naar de drainerende lymfeklieren.

Hier laat een representatieve analyse van mediastinale lymfeklieren van muizen zien dat een bescheiden maar consistente toename in de proportie CD 11 C positieve cellen wordt gedetecteerd in dieren die gesensibiliseerd en uitgedaagd zijn met Val Boomin vergeleken met met saline behandelde muizen. Bovendien laat analyse van het absolute celgetal van CD 11 C positieve CD 11 B positieve Val Boomin fits C positieve cellen uit de mediastinale lymfeklieren van Val in gesensibiliseerde en uitgedaagde muizen zien dat een meervoudig hogere toename in DC-aantallen optreedt in uitgedaagde muizen vergeleken met saline behandelde dieren. Na het bekijken van deze video zouden we een zeer goed begrip moeten hebben van onze techniek voor het analyseren van de maturatie alsmede de migratie van pulmonale dendritische cellen.

Zodra u deze techniek volledig beheerst, kunt u deze aanpassen om de respons van pulmonale dendritische cellen op andere pathogenen en andere experimentele factoren te beoordelen.