Het beoordelen van replicatie en Beta cel functie in Adenovirally-getransduceerde Geïsoleerd Rodent Eilandjes

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van signaleringspaden die veranderingen in de functionele bètacelmassa reguleren. Dit wordt bereikt in geïsoleerde ratteneilanden door de expressie van een gen te overexpresseren of te onderdrukken met behulp van adenovirale vectoren. Na deze manipulatie wordt de bètacelfunctie beoordeeld aan de hand van insulinesecretie en de replicatie van de eilanden gemeten via de incorporatie van tritiumgemarkeerd thymidine.

Uiteindelijk kunnen deze assays aantonen of een gen van belang de proliferatie en/of functie van bètacellen in vitro reguleert. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de ooglidbiologie, zoals de vraag of een specifiek onderdeel van een signaalroute invloed heeft op de groei en functie van bètacellen. Bereid een six-well plaat voor zonder weefselkweekcoating door twee milliliter gemodificeerd medium toe te voegen aan het vereiste aantal wells.

Een typisch experiment vereist bijvoorbeeld drie putjes, één voor een controle zonder virus, één voor een viruscontrole en één voor de experimentele groep; warm de plaat minstens 30 minuten voor op 37 °C in een weefselkweekincubator. Plaats direct na de isolatie van de rattenoogleden één tot 200 oogleden in elk putje van de voorbereide plaat. 60 oogleden worden gebruikt voor biochemische assays en de overige oogleden kunnen worden gebruikt voor genexpressiestudies of immunoblottings; schud de plaat voorzichtig om de oogleden in het midden van elk putje te brengen.

Pipetteer vervolgens onmiddellijk het adenovirus direct op de oogjes in het midden van de schaal. Gebruik een multipliciteit van infectie van 1 tot 500, afhankelijk van de effectiviteit van het adenovirus bij de overexpressie of knock-down van het eiwit van belang.

Efficiënte adenovirale penetratie tot in de kern van het ooglid vergroot de consistentie van de resultaten. Transductie van de oogleden direct na isolatie van het ooglid is essentieel.

Laat de plaat vijf minuten ongestoord staan en plaats deze vervolgens gedurende 24 uur in de incubator. Verwijder de plaat de volgende dag uit de incubator en zorg dat de ooglets voorzichtig opzwellen tot in het midden van de wells. Verplaats de ooglets met een 200 microliter micropipet naar een nieuwe well die vers medium bevat.

Als de oogjes aan de plaat blijven kleven, kunnen ze voorzichtig met de pipetpunt worden losgemaakt. Het is nuttig om een controlevirus te gebruiken dat GFP tot expressie brengt om een adequate transductie-efficiëntie te verifiëren door middel van confocale microscopie om de penetratie van het adenovirus in de eilandjeskerncultuur te visualiseren. De eilandjes gedurende één tot drie dagen langer bewaren, waarbij het medium dagelijks wordt ververst.

De cultuurtijd moet worden geoptimaliseerd door middel van pilotstudies en varieert afhankelijk van de experimentele doelen. Voeg voor de laatste 24 uur tritiatiumgetagd thymidine toe aan het medium in een concentratie van één microcurie per milliliter medium. Bereid eerst 50 milliliter van de werkende SAB vers voor in een 50 milliliter conische buis en warm dit op in een waterbad van 37 °C.

Pipetteer 10 milliliters werkende SAB in een conische buis van 15 milliliter en voeg 66,8 microliters 2,5 molair D-glucose toe. Om de SAB met hoog glucosegehalte te bereiden, voegt u 44,8 microliters 2,5 molair D-glucose toe aan de resterende 40 milliliters van de werkende SAB. Om de SAB met laag glucosegehalte te bereiden, labelt u vervolgens drie microcentrifugebuisjes van 1,7 milliliter.

Voeg voor elke put van de zes-wellplaat één milliliter PBS toe aan elke buis. Vergeet niet de institutionele protocollen voor de hantering en verwijdering van de radioactieve oogbollen te volgen. Selecteer met behulp van een stereoscoop of standaardmicroscoop 20 oogbollen van vergelijkbare grootte en breng deze over in elke microcentrifugebuis.

Elke buis kan bijvoorbeeld vijf kleine, 10 middelgrote en vijf grote ooglidspleten bevatten. Hoewel de resultaten aan het einde van het experiment worden genormaliseerd naar het totale eiwitgehalte, is het essentieel dat de ooglidspleten tussen de groepen qua grootte overeenkomen. Nadat de ooglidspleten door zwaartekracht of centrifugatie op de bodem van de buis zijn bezonken, wordt de PBS met een micropipet afgezogen en gewogen, waarna men overgaat tot het voorbereiden van de ooglidspleten voor de biochemische analyses.

Om de oogleden voor te bereiden op de assay voor insulinesecretie, moeten ze eerst worden gepreïncubeerd met laag-glucose SAB. Voeg hiervoor 400 µL van het laag-glucose SAB toe aan de buisjes en plaats deze met de doppen erop in de weefselkweekincubator voor 60 minuten. Na een uur wordt het gepreïncubeerde laag-glucose SAB weggezogen. Herhaal de preïncubatieprocedure om de basale insulinesecretie te meten.

Om echter de gestimuleerde insulinesecretie te meten, gebruikt u 400 microliters SAB met een hoog glucosegehalte in plaats van SAB met een laag glucosegehalte en incubeert u de eilandjes, zoals voorheen, gedurende 60 minuten. Aspireer na incubatie in SAB met een hoog of laag glucosegehalte de SAB voor de radio-immunologische assay voor insuline, die wordt uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant. Ga vervolgens verder met de thymidine-incorporatie-assay met dezelfde collectie eilandjes. Begin met de eilandjes die zojuist zijn gebruikt voor de insulinesecretie-assay.

Voeg één milliliter PBS toe en laat de oogjes door zwaartekracht bezinken. Aspireer vervolgens de PBS met een micropipet. Gooi dit weg en herhaal deze stap nogmaals.

Voeg vervolgens 500 µL ijskoud trichloorazijnzuur toe aan de eyelets en incubeer deze 30 minuten op ijs. Centrifugeer de buizen bij 4 °C. Verwijder vervolgens het TCA door aspiratie.

Voeg vervolgens 80 µL 0,3 normaal natriumhydroxide toe en incubeer de oogjes gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Vortex de monsters tijdens deze incubatie elke 10 minuten krachtig gedurende vijf tot 10 seconden. Voeg in parallel vier milliliter van een Conno Safe counting cocktail toe aan scintillation-buisjes voor vloeistofscintillatietelling van zeven milliliter.

Wanneer de incubatie van de eyelets is voltooid, voeg dan 50 µL van de eyelets toe aan een scintillatiebuisje. Schud het gedopte buisje kort en meet de radioactiviteit van de monsters in een vloeistofscintillatieteller. Om daarnaast de proteïneconcentratie te bepalen, brengt u 10 µL van de vilas over naar een commerciële bionic acid assay en volgt u het protocol van de fabrikant.

Normaliseer tijdens de latere data-analyse de resultaten naar de proteïneconcentratie met behulp van de beschreven protocollen. Eilandjesreplicatie en bètacelfunctie. Bij ratteneilandjes werd beoordeeld dat een adenovirale overexpressie van hypothetisch gen zes de eilandjesreplicatie robuust stimuleerde zonder de bètacelfunctie te veranderen.

Verhoogde expressie van gen zes, verhoogde DNA-synthese gemeten door de incorporatie van thymidine, aangezien de meeste cellen in het rat-eilandje bètacellen zijn. Verdere experimenten zouden kunnen aantonen dat deze toename in thymidine-incorporatie te wijten is aan een toename in de replicatie van bètacellen. De assay voor insulinesecretie toonde aan dat de overexpressie van gen zes geen invloed had op een van de primaire functies van de bètacel: de insulinesecretie bij lage en hoge glucoseconcentraties.

De toename in insulinesecretie bij lage en hoge glucoseconcentraties weerspiegelt de gezondheid van de eilandjes na behandeling met adenovirus. Indien een verhoogde expressie van gen zes de functie van de bètacellen zou belemmeren, zou dit waarschijnlijk blijken uit een afname van de insulinesecretie bij hoge stimulerende glucoseconcentraties. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in het meten van bètacelreplicatie en insulinesecretie om te bepalen of een specifiek gen de groei of functie van bètacellen beïnvloedt.