Vaste fase synthese van een gefunctionaliseerd Bis-Peptide Met behulp van "Veiligheid Catch" Methodologie

Het algemene doel van het volgende experiment is om een gefunctionaliseerd BSP-peptide te synthetiseren met behulp van vastfase-technieken. Dit wordt bereikt door een beschermd BIS-aminozuur te laden op hydroxyethylbenzoëzuurhars. Vervolgens worden cycli van diepe beschermingskoppeling herhaald om gefunctionaliseerde bis-aminozuren te koppelen, een proces waardoor het BIS-peptide wordt verlengd en de gewenste functionaliteit wordt vertoond.

Ten slotte wordt het eerste bis-aminozuur gemodificeerd met een alfa-aminozuur om het BIS-peptide van de hars te splitsen door vorming van DI Keto-pyrazine. De resultaten tonen een succesvolle synthese van een gefunctionaliseerd BSP-peptide aan met een goede ruwe zuiverheid en consistente geïsoleerde opbrengsten van ongeveer 10% op basis van vloeistofchromatografie-massaspectrometrieanalyse. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot parallelle synthese en bibliotheeksynthese van bis-peptiden, aangezien de BIS-peptiden op een vaste hars worden geassembleerd, wat gemakkelijker te manipuleren is dan reacties in oplossing en waarbij bijproducten eenvoudig via filtratie kunnen worden verwijderd.

Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien veel van de stappen moeilijk aan te leren zijn vanwege de vele belangrijke details die nodig zijn om ervoor te zorgen dat alle reacties zo volledig mogelijk verlopen. Bij vastefasesynthese is er geen mogelijkheid om tussenproducten te zuiveren. Om daarom een zuiver eindproduct te verkrijgen, moet elke reactie tot het maximale worden gedreven.

We raden aan om een checklist van de experimentele procedures op te stellen om verwarring te voorkomen, aangezien de stappen repetitief van aard zijn. Dit protocol begint met het laden van het eerste BSP-peptide, de bescherming van het eerste BSP-peptide en het gelijktijdige cappen van de hars. Begin met het laden van het eerste BSP-peptide door 114 milligram H-M-B-A-A-hars af te wegen in een reactievat van acht milliliter en voeg een magnetische roerstaaf toe.

Sluit de bovenkant van het vat af met het rubberen septum en spoel de buis gedurende ten minste vijf minuten door met Argonne. Bereid ondertussen de geactiveerde BIS-aminozuuroplossing voor zoals beschreven in het geschreven protocol. Ter aanvulling op deze video: breng de oplossing met een spuit over naar het reactievat en roer dit de volgende dag gedurende de nacht onder Argonne; verwijder vervolgens het septum en laat het reactiemengsel uitlopen.

Was de hars door ongeveer twee milliliter chloormethaan aan de hars toe te voegen. Roer gedurende 30 seconden tot een minuut en laat het vervolgens aflopen. Herhaal dit proces vier keer met DCM en was de hars daarna vijf keer met dimethylformamide.

Om de eerste bis-aminozuurgroep diep te beschermen en gelijktijdig de hars af te cappen, voegt u langzaam twee milliliter van een oplossing van 33% waterstofbromide in azijnzuur en DCM toe aan het reactievat. Laat dit 15 minuten roeren, waarna de hars wordt afgetapt en vijf keer wordt gewassen in DCM. Herhaal de D-beschermingsvolgorde nogmaals.

Was vervolgens de hars vijf keer met DCM, gevolgd door vijf keer met DMF, en neutraliseer de hars door deze twee keer te wassen met een 5% volume/volume oplossing van D-I-P-E-A in DMF. Was daarna nogmaals vijf keer met DCM en vijf keer met DMF. Nu kan de koppeling van het beschermde gefunctionaliseerde bis-aminozuur worden uitgevoerd.

Herstel eerst een inerte atmosfeer in het reactievat dat de hars bevat door dit drie keer te spoelen met watervrij DCM. Plaats vervolgens een septum en een argonlijn voor het purgen en spoel het vat door één tot twee milliliter watervrij DCM toe te voegen en 30 seconden te roeren. Laat het vat daarna draineren totdat de borrelsteen van de argonlijn begint te stijgen.

Herhaal dit proces nog ten minste één keer. Bereid vervolgens een oplossing van gefunctionaliseerd bis-aminozuur in een vlamgedroogde reageerbuis onder een argonatmosfeer. Voeg 47 µL DIC toe en roer gedurende 90 minuten.

Voeg vervolgens 35 µL D-I-P-E-A in 666 µL watervrije DMF toe aan de hars en roer nog eens vijf minuten. Breng de vooraf geactiveerde BIS-aminozuuroplossing met een injectiespuit over naar het vat en roer dit de volgende dag een nacht lang. Giet het reactiemengsel af en was dit tweemaal met watervrije DCM onder argon.

Een kritische stap in deze procedure zijn de bis-aminozuurkoppelingen. Om de ringsluiting van di-ketopiperazines te waarborgen, maken we gebruik van langere reactietijden met aanvullende activeringsmiddelen. Voeg om de sluiting van de di-ketopyrazine te bevorderen een HOAT- en DIC-oplossing toe en roer gedurende één uur onder argon.

Verwijder vervolgens het septum en laat het reactiemengsel weglopen. Was de hars vijf keer met DCM en vijf keer met DMF. Deze sectie behandelt de volledige bescherming van het gefunctionaliseerde BIS-aminozuur, de volledige bescherming van Fmoc en de acylering van het eerste BIS-aminozuur.

Om de diepe protectie van het geprotectioneerde gefunctionaliseerde bis-aminozuur uit te voeren, voegt u langzaam twee milliliter van een oplossing van TFA en TIPS toe aan het reactievat en roert u gedurende één uur. Na het aftappen wast u de hars gedurende ongeveer 30 seconden met DCM en tapt u deze vervolgens af; herhaal deze DCM-wasstap vijf keer. Herhaal daarna de volledige wasreeks voor de diepe protectie van de hars volgens de A-D-C-M-D-M-F-wasvolgorde. Neutraliseer de hars door deze twee keer te wassen met een 5% volume/volume oplossing van D-I-P-E-A in DMF.

Voer vervolgens nogmaals een D-C-M-D-M-F wasbeurt uit. Vanaf dit punt kan het BIS-peptide worden verlengd met andere gefunctionaliseerde bis-aminozuren, worden gefunctionaliseerd op het leidende stikstofcarbonzuur, of beide. Om de FM-groep te deblokkeren, voegt u een oplossing van 2 ml 20% piperidine in DMF toe en mengt u de reactie gedurende 20 minuten.

Laat de hars uitlekken en was deze vijf keer met DMF. Herhaal dit proces nogmaals na een extra wasbeurt van de hars. Isoleer als laatste stap het eerste bis-aminozuur door de bereide aminozuuroplossing aan het reactievat toe te voegen en zes uur lang te roeren.

Was de hars vijf keer met DCM en vijf keer met DMF. Het laatste deel van dit protocol omvat het verwijderen van de Bach-groep van het aan de hars gebonden aminozuur en de splitsing van de hars. Voeg eerst twee milliliter van een één-op-één T-F-A-D-C-M-oplossing toe aan het reactievat en roer 30 minuten.

Laat de harsen aflopen en was deze vijf keer met DCM. Herhaal dit proces vervolgens nogmaals. Was en laat de harsen 30 seconden aflopen, vijf keer met DCM en vijf keer met DMF.

Voeg vervolgens twee milliliters van een oplossing van 10% D-I-P-E-A in anhydere DMF toe en roer 24 tot 48 uur. Verzamel tenslotte het reactiemengsel in een vooraf gewogen rondbodemkolf. Overbreng 30 µL van deze oplossing naar 450 µL Tetra Hydro FU in een lc MS-vial en dien deze in voor analyse.

Was de hars met extra aliquoten DMF en verzamel deze in de rondbodemkolf. De volgende methoden kunnen worden gebruikt om chemische transformaties op de hars gedurende de synthese te monitoren. Om vrije hydroxylgroepen te detecteren, wordt de methylroodtest uitgevoerd door eerst ongeveer één milligram droge hars met een wegwerppipet te verwijderen.

Spoel het mengsel in een reactievat van vier milliliter. Voeg een methylroodoplossing toe, bereid zoals beschreven in de tekst, en roer gedurende vijf tot 10 minuten. Giet af en was de hars vijf keer met DCM; oranje of rode harskralen duiden op de aanwezigheid van vrije hydroxylgroepen.

Deze test kan worden gebruikt om de belading van het eerste bis-aminozuur en de resin-cappingstappen te beoordelen. Om secundaire groepen te detecteren, wordt de chloraaltest uitgevoerd door ongeveer één milligram droge resin via een wegwerppipet over te brengen naar een klein vial. Voeg drie druppels toe van zowel een 0,8 millimolaire chloraaloplossing in DMF als een 2% zuur-aldehydeoplossing in DMF.

Laat dit vervolgens vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur staan. In dit geval zijn blauwe of paarse harsbolletjes een indicatie dat er vrije secundaire aminen aanwezig zijn op het aan de hars gebonden complex. Om de activeringsefficiëntie te bevestigen, wordt de activeringstrap-test uitgevoerd; het geactiveerde complex tijdens de synthese kan worden beoordeeld door 5 tot 10 µL van de geactiveerde oplossing over te brengen naar een vloeistofchromatografie-massaspectrometrie-vial met 50 µL olaine en dit handmatig te mengen.

Gedurende enkele seconden moet de oplossing geel worden, waarna deze wordt verdund met 450 µL tetra hydro uran en wordt ingediend voor lc-ms-analyse. Het eindproduct en geactiveerde tussenproducten kunnen worden beoordeeld met een LC-MS-systeem uitgerust met een C18 reverse-phase kolom en een oplosmiddelsysteem van water/acetonitril met 0,1% mierenzuur. Dit LC-MS-UV-chromatogram geeft een voorbeeld van de goede zuiverheid van het ruwe product.

De belangrijkste piek in het spectrum bij 21,3 minuten vertoont een massa die consistent is met de verwachte productmassa. Dit kan worden gevisualiseerd in het massaspectrum van het ruwe product, waarbij de piek belangrijke pieken onthult die overeenkomen met de massa, plus de massa van het natriumion, evenals de massa minus de massa van de IV DDE-beschermingsgroep. Hier wordt de LCMS UV-trace van de gezuiverde spectra getoond, die een zeer zuiver product onthult bij 21,3 minuten, en het massaspectrum dat de identiteit van deze gezuiverde piek bevestigt.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe vaste-fase-technieken kunnen worden gebruikt om gefunctionaliseerde bis-peptiden te synthetiseren na de ontwikkeling ervan. Zodra deze techniek beheerst is, heeft deze de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van bis-peptiden om toepassingen in proteïne-proteïne-interacties en katalyse te verkennen. Deze techniek kan, indien correct uitgevoerd, leiden tot de synthese van een gefunctionaliseerde bis-peptide trimeer in vier tot vijf dagen.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de beads gedurende de reactie- en wasstappen in de betreffende oplossingen ondergedompeld moeten blijven. Andere methoden, zoals parallelle synthese of library-synthese, kunnen worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het effect van stereochemie of alternatieve functionaliteiten op de eiwitbinding of katalytische activiteit. Houd er rekening mee dat het werken met organische reagentia extreem gevaarlijk kan zijn; neem daarom altijd voorzorgsmaatregelen, zoals het gebruik van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en een zuurkast, bij het uitvoeren van deze procedure.