Een vloeibare fase Affiniteit Capture test met behulp van magnetische korrels aan eiwit-eiwit interactie te bestuderen: het poliovirus-Nanobody Voorbeeld

Dit protocol maakt gebruik van de interactie tussen poliovirus en Poliovirus-herkennende nanobodies om een eenvoudige kwantitatieve affiniteitsopvanganalyse in de vloeistoffase te demonstreren. In principe worden met kobalt gecoate magnetische kralen gebruikt om getagde eiwitten en alle daarmee interagerende radiogemarkeerde eiwitten neer te slaan. Meng eerst de gemarkeerde en getagde eiwitten en laat deze incuberen bij kamertemperatuur.

Voeg vervolgens magnetische beads toe die de tag herkennen en scheid de gebonden fractie van het gelabelde eiwit van de ongebonden fractie met behulp van magneten. Meet daarna het signaal van het gelabelde eiwit in de ongebonden fractie en bepaal de hoeveelheid gelabeld eiwit die in de ongebonden fractie is aangetroffen. De resultaten van deze affiniteitsassay in vloeistoffase zijn uiterst nuttig bij het analyseren van eiwitten die gevoelig zijn voor conformationele conversie.

Deze affiniteitsopvanganalyse in vloeistoffase kan inzicht bieden in de interactie tussen poliovirus-herkennende nanobodies en verschillende poliovirusantigenen. De methode kan ook worden toegepast op andere eiwit-eiwitinteracties, mits één eiwit gelabeld kan worden en het andere gedetecteerd kan worden. We hebben deze methode oorspronkelijk ontwikkeld toen we geïnteresseerd waren in het onderzoeken van de interactie tussen poliovirus-herkennende nanobodies en verschillende poliovirusantigenen.

Aangezien het poliovirus gevoelig is voor conformationele veranderingen wanneer het aan een vast oppervlak is gebonden, is het gebruik van e LSA beperkt. Een systeem op basis van een vloeistoffase verdient daarom de voorkeur. Een voorbeeld van zo'n vloeistoffasesysteem dat vaak wordt gebruikt in poliovirusonderzoek is de micro protein.

Een immunoprecipitatie-assay. Hoewel deze test zijn toepasbaarheid heeft bewezen, is hiervoor de gekristalliseerde structuur van een conventioneel antilichaam vereist, welke afwezig is bij nanobodies. Deze nanobodies, die interessante en zeer stabiele single-domain antilichamen zijn, kunnen eenvoudig worden gemodificeerd met verschillende teksten.

De veelgebruikte His-tag vertoont affiniteit voor bivalente ionen, zoals nikkel en kobalt, die op hun beurt eenvoudig op magnetische beads kunnen worden gecoat. Daarom hebben we een eenvoudige kwantitatieve affiniteitscapture-assay ontwikkeld op basis van met kobalt gecoate magnetische beads.

Resuspendeer de magnetische kralen door te vortexen en breng 10 µL van elk monster over in een buisje; pelletteer de kralen met behulp van een magneet. Verwijder het heldere supernatant om de kralen te wassen. Voeg 150 µL bindingsbuffer toe.

Oogst de beads met behulp van een magneet en verwijder het supernatant na een tweede wasbeurt. Resuspendeer de beads in 40 µL bindingsbuffer voor elk monster en voor de controle. Bereid voor de achtergrond in monster één een put voor zonder radiogemarkerd virus, maar met een gelijk volume bindingsbuffer voor de controle.

Neem een monster van 100% radioactiviteit. Voeg alle componenten toe aan een well, maar vervang het nanobody door bindbuffer. Voeg nu 2000 counts per minute van S 35 gelabeld poliovirus zeven stam type één toe aan alle monsters in een totaalvolume van 80 µL bindbuffer.

Accepteer controle. Monster één. Voeg 10 µL nanobody-verdunning toe aan elk monster.

Meng het geheel 10 seconden goed op een shaker en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 40 µL van de gewassen magnetische bead-suspensie toe en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur onder voortdurend schudden; pellet de beads met een magneet en breng het geklaarde supernatant over in een buisje om de radioactiviteit van elk monster te meten. Breng 50 µL van het supernatant over in een telkolf. Voeg drie milliliter scintillatiemiddel toe en lees dit af in de scintillatieteller.

Was de gebruikte magnetische kraaltjes in een buisje met water door middel van een tegenstroom-extractie en centrifugeer deze 2 minuten bij 500 ×g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de kraaltjes in 6 mL 0,5 M natriumhydroxide. Verdeel de suspensie vervolgens over meerdere buisjes en incubeer deze vijf minuten in een ultrasoon bad.

Nadat de beads met een magneet zijn gepellet en het supernatant is verwijderd, voegt u één milliliter 2% SDS-oplossing toe aan elke buis, waarna u vijf minuten mengt door middel van vortexen en foilen. Oogst nu de beads. Voeg één milliliter 0,2 molair EDTA pH 7 toe aan elke buis en incubeer de buizen vijf minuten in een ultrasoonbad.

Verzamel vervolgens de beads en was de beads drie keer met één milliliter water, gevolgd door één milliliter 10 millimolaire cobaltchloride-oplossing. Plaats de buisjes 10 minuten op een schudapparaat. Oogst daarna de beads met een magneet en resuspendeer deze in één milliliter bindingsbuffer.

Was twee keer in één milliliter 20% Ethanol en resuspendeer de beads tot slot in hun oorspronkelijke volume 20% ethanol om geregenereerde beads te verkrijgen in een concentratie van 40 milligram per milliliter. Corrigeer voor achtergrondradioactiviteit door controlemonster één in te stellen als de 0% radioactiviteitswaarde en controlemonster twee als de 100% radioactiviteitswaarde.

Bereken nu voor elk monster het percentage radioactiviteit in het supernatant als maat voor de totale precipitatie van het radiogemarkeerde virus door het nanobody. Dit experiment evalueert de affiniteit van PVSS 38 C en een antilichaam specifiek voor het poliovirus met behulp van drie verschillende antigenen van het poliovirus: natief antigeen, verhit antigeen en 14 s subunits. Interessant is dat de radioactiviteit in het supernatant van de monsters die radiogemarkeerde 14 s subunits bevatten, afneemt bij een toename van de concentraties van het nanobody PVSS 38 C. Dit duidt op een toename van de hoeveelheid poliovirus 14 s subunits die verbonden zijn aan het nanobody PVSS 38 C, en indirect aan de magnetische beads.

Aangezien er geen affiniteit van pvs S 38 C voor de N-antigene en H-antigene vorm van poliovirus is waargenomen, lijkt het nanobody specifiek te zijn voor de 14 s-subeenheid van poliovirus. De affiniteit van het nanobody voor zijn antigenen, gemeten met deze methode, is specifiek, net als bij het niet-gerelateerde nanobody NB one, dat geen reactiviteit vertoont tegen de drie antigene vormen van poliovirus.

Dit systeem levert een hoge reproduceerbaarheid, zoals blijkt uit deze dosis-responscurve die is gegenereerd door verschillende onderzoekers op verschillende dagen. Eenmaal beheerst, kan deze betrouwbare assay voor affiniteitsvastlegging in vloeistoffase binnen twee uur correct worden uitgevoerd, inclusief het recyclen van de beads. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u deze op magnetische beads gebaseerde assay voor affiniteitsvastlegging in vloeistoffase kunt gebruiken bij het bestuderen van de interactie tussen verschillende eiwitten, vooral wanneer systemen op basis van een vaste fase niet kunnen worden gebruikt.