Een Galvanotaxis Assay voor Analyse van neurale precursoren celmigratie Kinetics in een extern aangelegd Direct Current Electric Field

Het algemene doel van deze procedure is om de migratie van uit volwassenen afgeleide neurale precursorcellen te visualiseren in de aanwezigheid van een gelijkstroomveld. Dit wordt bereikt door eerst subependymale neurale precursorcellen uit de volwassen muis te isoleren en te kweken. De volgende stap is het voorbereiden van Galvan Axxis-kamers en het overbrengen van de neurale precursorcellen naar de kamers.

De laatste stap is het aanbrengen van een gelijkstroom elektrisch veld over de Galvan Axxis-kamer en het uitvoeren van time-lapse imaging om de migratie van neuroprecursoren te observeren. Uiteindelijk legt de time-lapse imaging microscopie de galvantactische eigenschappen vast van neuroprecursoren in hun gedifferentieerde en ongedifferentieerde toestanden. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de galvano-taxis van neuroprecursorcellen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals een muismodel voor beroerte, voor de rekrutering van neuroprecursoren naar laesieplaatsen om neuronaal herstel te bevorderen.

Rob Pilley Post, een promovendus uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Wanneer u aan deze procedure begint, moeten de NPC's zeven dagen in kweek zijn geweest, zodat de vrijzwevende primaire neurosferen klaar zijn om te worden geoogst. Indien vereist, begin met het voorbereiden van drie Galvan Axxis-kamers door drie vierkante glasplaatjes te plaatsen.

Ten eerste, laat dekglasjes een nacht lang in een fles met 6 N zoutzuur weken. Zet de volgende ochtend vroeg de Matrigel klaar om langzaam op ijs te ontdooien. Na vier uur is deze klaar voor gebruik om de kamer op te bouwen.

Gebruik eerst een glassnijder met diamantpunt om zes rechthoekige glasstrips uit een nieuw vierkant te snijden. Nummer één, dekglasjes. Verplaats de zuurgewassen vierkante plaatjes en rechthoekige strips naar een laminaire flowkast.

Was de glazen strips met 70% ethanol, gevolgd door autoclaafwater van weefselkweekkwaliteit. Laat ze aan de lucht drogen of droog ze op pluisvrije papieren handdoeken. Breng vervolgens vacuümvet aan op de omtrek van één oppervlak van elke vierkante glazen objectglas en kit deze vast aan de basis van de 60 millimeter plastic.

Petrischalen. Breng vacuümvet aan op één zijde van de rechthoekige glasstripjes en seal deze aan de tegenoverliggende randen van het vierkant. Glasplaatjes om vierkanten te maken met een centraal gootje in het midden van elke schaal.

Steriliseer deze gemodificeerde glazen vierkantjes of kamers gedurende ten minste 15 minuten met UV-licht in een zuurkast. Pipetteer vervolgens 250 tot 300 µL polyollysine op het centrale gootje van de kamers. Incubeer de kamers daarna twee uur bij kamertemperatuur, ongeveer 15 minuten voordat de incubatie eindigt.

Bereid de Matrigel-oplossing na twee uur, aspireer de poly-L-lysine en was de centrale troggen met één milliliter autoclaafwater. Pipetteer vervolgens 250 tot 300 µL Matrigel-oplossing op de centrale troggen en incubeer de kamers gedurende een uur bij 37 °C. Aspireer na de incubatie de Matrigel-oplossing.

Was daarna voorzichtig de centrale troggen met één tot twee milliliters SFM. Pipetteer vervolgens 100 microliters E-F-H-S-F-M of F-B-S-S-F-M op de centrale troggen ter voorbereiding op de gecultiveerde cellen. Pipetteer daarna vier tot vijf milliliters van de cultuur die de neurosferen bevat in een nieuwe Petrischaal van 60 millimeter.

Plaats vervolgens de Petrischaal op de tafel van de telmicroscoop onder het 5x objectief. Gebruik een P 10 pipet om voorzichtig vijf tot acht complete neurosferen over te brengen naar het centrale reservoir van elke kamer. Tot maximaal vier.

Neurosferen kunnen in één keer worden overgebracht, maar zorg ervoor dat ze niet dissociëren met de neurosferen in de centrale troggen. Verspreid ze voorzichtig zonder het matrigel-substraat te verstoren. Voeg vervolgens nog eens 150 µL E-F-H-S-F-M of F-B-S-S-F-M toe aan de centrale troggen.

Kweek nu de cellen in een bevochtigde incubator. Na 17 tot 20 uur kweekten zullen ongedifferentieerde NPC's beschikbaar zijn na 69 tot 72 uur. In kweek zullen gedifferentieerde NPC's beschikbaar zijn.

Select onder de telmicroscoop de kamer met de beste cellen voor live cell imaging migratieanalyse. De cellen moeten rond zijn, bijna volledig gedissocieerd van hun neurosfere en nog geen uitlopers hebben gevormd, of dit pas net zijn begonnen in een zuwell. Bereid een kamerdeksglas voor.

Was een vierkant glazen dekglas met 70% ethanol, vervolgens met geautoclaveerd water en breng een strip vacuümvet aan op twee parallelle randen. Sluit nu de kamer af. Aspireer eerst het kweekmedium uit het centrale troggedeelte en sluit vervolgens het dekglas snel af op de rechthoekige wanden, als een dak.

Laad vervolgens 100 µL vers medium in het centrale reservoir via capillaire werking. Gebruik nu vacuümvet om randen te creëren voor de reservoirs met kweekmedium. Zorg dat aan beide uiteinden van het centrale reservoir bij het live-cell imaging-systeem agrose-gelbuisjes, zilver-zilverchloride-elektroden en twee petrischalen van 60 mm klaarliggen voor gebruik.

Laat de kamers 20 tot 30 minuten rusten in een omgeving van 37 °C en 5% koolstofdioxide om als reservoirs voor kweekmedium te dienen. Boor tijdens deze tijd met een Dremel of pipettegereedschap gaten in de deksels van de twee lege Petrischalen en in het deksel van de Petrischaal voor de Galvan Axxis-kamers; breng 1,5 tot 2 mL medium aan aan weerszijden van het centrale trogje en voeg zeven tot acht mL SFM toe aan elke lege Petrischaal. Plaats één Petrischaal aan elke zijde van het centrale trogje van de kamer en plaats één elektrode in elke schaal.

Overbrug de opening tussen de kamer en de Petrischalen om elektrische continuïteit te creëren. Verbind de elektroden via de Agros-gelbruggen met een externe voeding met een M-meter in serie om de elektrische stroom te meten en schakel de voeding in. Gebruik een vol-meter om de sterkte van het elektrisch veld direct over het centrale trogje te meten.

Pas de output van de voeding naar behoefte aan. Start nu de time-lapse-module op het beeldsysteem. Selecteer in de Axio vision-software multidimensionale acquisitie en klik op see.

Selecteer voor de kanalen kanaal zes en klik op T voor time-lapse. Stel de intervallen voor de time-lapse in op één minuut, stel de duur in op acht uur in de velden voor vóór en na het tijdstip, en selecteer het tijdstip vóór en na. Klik nu op start en laat het experiment de gewenste tijd lopen; ga na voltooiing van de assay verder met de IHC-analyse.

Kinematische analyse toonde aan dat ongedifferentieerde NPC's in aanwezigheid van een DCEF van 250 millivolt per millimeter een sterk gerichte en snelle galvanotaxis richting de kathode vertonen bij deze veldsterkte; meer dan 98% van de ongedifferentieerde NPC's migreerde gedurende de volledige zes tot acht uur dat zij werden afgebeeld. In afwezigheid van A-D-C-E-F werd een willekeurige beweging van de cellen waargenomen.

Aangezien dode cellen niet migreren, suggereert dit dat ze gedurende deze periode levensvatbaar blijven. In afwezigheid of aanwezigheid van A-D-C-E-F vertoonden gedifferentieerde fenotypes een verwaarloosbare migratie, zowel in de aanwezigheid als in de afwezigheid van A-D-C-E-F-subsets van gedifferentieerde cellen. Er waren verlengde uitlopers die de neiging hadden om loodrecht op de richting van de DCEF te richten, maar er werd geen merkbare translocatie van het cellichaam waargenomen.

Immunokleuring bevestigde dat NPC's een positieve expressie van de neurale precursor marker nestin behielden na zes uur blootstelling aan DC EF. In de assays waarbij NPC's werden geïnduceerd om te differentiëren naar mature fenotypes, vertoont de meerderheid van de cellen expressie van de mature astrocytmarker glial fibrillary acidic protein of GFAP na zes uur blootstelling aan DCEF. Na deze procedure kunnen inzichten worden verkregen in de cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij het omzetten van het gelijkstroom-elektrisch veld in celmotiliteit door gebruik te maken van genetische knockout-modellen.

Of meneer, een voorbeeld.