Analyse van de neurale lijst migratie en differentiatie door Cross-soorten transplantatie

Het algemene doel van deze procedure is om een dorsaal neuraalbuisexplant van een kwartelsembryo te transplanteren in een embryo van een kip van een overeenkomstig stadium, om zo de migratie en het lot van neurale kamcellen te volgen. Dit wordt bereikt door eerst een klein gat in het IGN-membraan van het gastembryo van de kip te maken om toegang te krijgen tot de neurale buis. Het donor-kwartelsembryo wordt vervolgens uit het ei gehaald om het voor te bereiden op de excisie van het transplantaat.

In de volgende stap wordt het interessegebied uit de neurale buis van het gastembryo geëxciseerd. Vervolgens wordt een vergelijkbaar gebied uit de neurale buis van de donor geëxciseerd voor het transplantaat. Daarna wordt de neurale buis van de donor getransplanteerd in de neurale buis van de gastheer.

Ten slotte wordt het chimerische embryo geïncubeerd tot het gewenste stadium voor de detectie van aangekomen neurale kamcellen in het gekozen orgaan. Uiteindelijk kan de migratie en differentiatie van donor-afgeleide neurale kamcellen naar diverse locaties in het gastheerembryo worden gevisualiseerd via immunofluorescentiemicroscopie. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, omdat de stappen voor microdissectie en transplantatie zeer fijne motorische vaardigheden vereisen, waardoor ze moeilijk aan te leren zijn.

Begin met het afwassen van eventuele vuildeeltjes van de kouseiern met lauwwarm water. Plaats de eieren horizontaal op een dienblad en markeer vervolgens de zijden die naar boven wijzen met potlood om de regio aan te duiden waar het embryo zich zal bevinden. Voor de X ovo-preparatie van donorembryo's worden de kwartelsbenen met de stompe zijde naar boven geïncubeerd.

Plaats vervolgens de eieren in een bevochtigde incubator op 38 °C en schakel de wiegfunctie in. Nadat de eieren zijn uitgebroed, worden de bovenkanten gesteriliseerd door ze te besproeien met 70% ethanol en vervolgens snel af te vegen met een Kimwipe. Om absorptie door de eierschaal te voorkomen, wordt elk gesteriliseerd ei op een individuele eierhouder geplaatst, vergelijkbaar met de hier getoonde petrischaal die is bekleed met gevouwen Kimwipes. Tik vervolgens met gesteriliseerde AA-pincetten een klein gaatje in het bovenste oppervlak van de eierschaal aan de gepunte zijde van het ei.

Voorzie een spuit van vijf milliliter met een hypodermische naald van 18,5 gauge. Steek vervolgens de naald verticaal in het gat in de eierschaal, met het schuine vlak naar de punt van het ei gericht. Om te voorkomen dat de dooier per ongeluk door zuiging wordt beschadigd, wordt het gat zoals eerder beschreven gereinigd met 70% ethanol en vervolgens afgedicht met plakband.

Tik vervolgens met de double A-pincet een ander gat in het gemarkeerde bovenoppervlak van het horizontale pootje, net voor de apex. Voeg daarna één zijde van de gebogen iris-pincet in het gat in, parallel aan het ei. Knijp vervolgens in het schild en werk in een cirkelvormige beweging.

Maak een opening van twee centimeter in diameter in het kippenei en gooi het verwijderde stukje eierschaal weg. Het embryo moet zichtbaar zijn als een ondoorzichtige schijf bovenop de dooier. Verwijder alle onbevruchte eieren, die herkenbaar zijn aan een kleine witte vlek op het oppervlak van de dooier of de afwezigheid van het blastoderm.

Buig nu, terwijl u een geschikte oogbescherming draagt, een hypodermische naald van 26,5 gauge onder een hoek van 45 graden, beginnend bij de basis van de naald. Nadat de gebogen naald met de schuine zijde naar boven is bevestigd aan een spuit van 1 ml, vult u de naald met verdunde India-inkt. Puncteer het dooier Membraan buiten de omtrek van de blaster en schuif de punt van de naald onder het embryo, dicht bij het oppervlak van de dooier, maar niet in de embryonale lagen.

Inject vervolgens net genoeg inkt om het embryo te omtrekken en voorkom dat er luchtbellen worden geïnjecteerd. Trek de naald voorzichtig terug. Gebruik nu een stereomicroscoop en een lichtbron met een beperkte warmtebelasting, zoals de getoonde glasvezel-flexibele lamp.

Bepaal het stadium van de embryo's volgens de methode van Hamburger en Hamilton. Noteer het stadium op de eierschalen. Breng vervolgens twee tot drie druppels warme, steriele Ringer-oplossing aan op het oppervlak van de embryo's om uitdroging en contaminatie te voorkomen.

Span vervolgens parafilm over het oppervlak van de eieren om de vensters tijdelijk af te dichten. Bereid daarna de kwas-eieren voor op transplantatie. Vul een Petrischaal met ringer-oplossing voordat de eieren uit de incubator worden gehaald.

Open vervolgens de eieren aan de stompe zijde met gebogen pincetten om het embryo bloot te leggen. Maak met dissectiescharen vier sneden in de vorm van een vierkant door het vili-membraan en het blastoderm buiten het embryo, waarbij u er zeker van bent dat alle sneden elkaar raken. Pak vervolgens met gebogen iris-pincetten voorzichtig een snijrand vast, til het embryo uit het ei en breng het over naar de voorbereide petrischaal.

Verwijder tenslotte voorzichtig het vitellijnmembraan met een pincet nr. 5 en bepaal vervolgens het stadium van de embryo's onder een dissectiemicroscoop. Verwijder de Parafilm van het gast-kiजembryo. Maak vervolgens met een geslepen wolfraamnaald een klein gaatje in het vitellijnmembraan in de gewenste regio van de neurale buis.

Voeg een druppel ringer-oplossing toe aan het embryo. Maak vervolgens, voor unilaterale transplantaties, zoals in deze video wordt uitgevoerd, met een getrokken glazen naald voorzichtig transversale rostrale en caudale incisies in het middenhersengedeelte van de neurale buis, zonder het lumen te penetreren. Snijd daarna bilateraal tussen de dorsale neurale buis en het pariëtale mesoderm.

Scheid ten slotte voorzichtig het uitgesneden X-explantaat van de neurale buis en verwijder het vervolgens uit het embryo door het op te zuigen met een glazen micropipet. Gebruik eerst een kwartelsembryo van een vergelijkbare ontwikkelingsfase. Snijd vervolgens een deel van de neurale buis uit met een vergelijkbare grootte als zojuist getoond en zuig het donor-X-explantaat op in een glazen micropipet die Ringers-oplossing bevat.

Breng het X-explantaat over naar de plek naast het uitgesneden gebied van het kuiken-gastorganisme. Gebruik vervolgens een getrokken glazen naald om het explantaat te oriënteren door het voorzichtig in het geablateerde gebied te geleiden. Voeg voorzichtig enkele druppels Ringers-oplossing toe aan het embryo om uitdroging te voorkomen.

Sluit slutतः het venster af met verpakkingstape, waarbij u ervoor zorgt dat de tape het gehele gebied van het venster in het ei afsluit. Plaats het ei terug in de incubator tot het gewenste stadium is bereikt. Schakel de schommelfunctie uit tijdens het incuberen van de embryo's; de eieren kunnen twee keer per dag voorzichtig met de hand worden gedraaid om de levensvatbaarheid te verhogen. Indien latere ontwikkelingsstadia worden nagestreefd, toont deze representatieve afbeelding van het gegrafts gebied van de neurale buis na zes uur re-incubatie tot HH 11 de verwachte inbouw van het gegrafts weivogel-donortissue in de neurale buis van het gastkuiken. Deze dwarsdoorsnede door het gegrafts gebied bij HH 11 laat neurale kamcellen zien die zijn gelabeld met hnk, waarvan er één lateraal wegmigreert van de neurale buis.

Koutdovecellen die bijdragen aan de migratiestroom van neurale kamcellen en aan de neurale buis zijn duidelijk gelabeld met QCPN. In latere stadia kunnen cellen afgeleid van koutdove neurale kamcellen worden gevolgd naar hun uiteindelijke doelweefsel. Zoals in deze figuur te zien is, zijn QCPN-gelabelde cellen verspreid in het embryo van de kuiken meen chi van het maxillaire proces. Bij E5 kan het QCPN-antilichaam gemakkelijk worden gecombineerd met andere antilichamen om de differentiatie van koutdove neurale kamcellen te onderzoeken.

In de gastomgeving. Zoals hier te zien is, zijn trigeminale sensorische neuronen afgeleid van neurale kamcellen van korthandige kwikdoelen gelabeld met QCPN- en T UJ one-antilichamen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals immunohistochemie en in situ hybridisatie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals uit welke weefsels neurale kamcellen voortkomen en welke genen neurale kamcellen tot expressie brengen terwijl ze differentiëren tot diverse weefsels.