Visualisatie van bacteriële toxine geïnduceerde responsen met Live Cell Fluorescentie Microscopie

Het doel van deze procedure is om de respons van immuuncellen op bacteriële toxines te visualiseren. Eerst wordt het toxine tot expressie gebracht in en gezuiverd uit BL 21 gold cellen. Zodra de activiteit en concentratie van het toxine zijn bevestigd, wordt het toxine toegediend aan immuuncellen.

Er wordt gebruikgemaakt van een micro-injector en live-cell microscopie met hoge snelheid. Analyse van de resulterende beelden onthult de real-time kinetiek van immuuncelresponsen op de toxine. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de immunologie, zoals het mechanisme van inflammasoomactivatie.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in immuuncelresponsen gemedieerd door toxinen, kan ze ook worden toegepast op andere stimuli, waaronder chemotactische attractoren. We kregen het idee voor deze methode tijdens het bestuderen van de interactie van bacteriën met gecultiveerde immuuncellen, waarbij we zeer variabele interacties tussen de bacteriën en de immuuncellen observeerden. Begin de zuivering van strep lysin O of SLO met een cultuur van BL 21 gold-cellen die PAG three SLO bevatten.

Kweek het plasmid tot een OD van ongeveer 0,6. Om de eiwitexpressie te induceren, voegt u vijf milliliter 20% OSes toe aan de cultuur en schudt u deze 3 uur lang bij 225 RPM op kamertemperatuur. Draag de bacteriën vervolgens over naar een centrifugefles van 500 milliliter.

Centrifuge de kweek vervolgens 12 minuten bij 12,000 ×g en 4 °C. Decanteer na het centrifugeren het supernatant en bewaar het pellet bij -80 °C gedurende de nacht of langer indien nodig. Om het tot expressie gebrachte SLO te zuiveren, voegt u 10 mL lyse-wasbuffer toe aan het bevroren pellet, aangevuld met Triton X 100, lysozym en fenylmethylsulfonylfluoride, en pipetteert u dit ongeveer 15 minuten op en neer.

Om te resuspenderen, wordt het pellet gesuspendeerd terwijl het monster op ijs wordt bewaard. Draag het geresuspendeerde pellet over naar een ronde polypropylene Oak Ridge-buis van 50 milliliter. Soniceren het lysaat met een probe-sonicator bij 40% output vijf keer gedurende 30 seconden per keer, met intervallen van 30 seconden en tussentijds 30 seconden op ijs.

Centrifuge vervolgens het gesoniceerde lysaat bij 39.000 ×g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Voeg na het centrifugeren het bacteriële supernatant toe aan één milliliter gewassen nikkel-NTA-beads. Incubeer de nikkel-NTA-beads en het lysaat samen gedurende 2,5 uur bij 4 °C onder zachte schudding na de incubatie.

Pellet de kraaltjes door te centrifugeren bij 400 ×g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Let op dat alle verdere wasstappen en de elutie worden uitgevoerd met deze centrifugeringsinstellingen, tenzij anders vermeld. Na de centrifugering.

Combineer 30 µL van het supernatant met 10 µL 4x SDS-monsterbuffer in een microcentrifugebuisje en bewaar dit op ijs voor zuiverheidsanalyse. Gooi vervolgens de rest van het supernatant weg en was de beads vier keer in lice wasbuffer en één keer in zoutbuffer, waarbij na elke wasbeurt wordt gecentrifugeerd. Zorg er vanaf dit punt op dat het monster te allen tijde op ijs bewaard blijft.

SLO is een zeer redoxgevoelig eiwit en zal snel zijn activiteit verliezen bij een temperatuur van 37 °C, zelfs gedurende een korte periode. Voeg om het SLO-eiwit te elueren 1 mL elutiebuffer en 5 µL 1 M DTT toe aan de beads en incubeer dit 10 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens en verzamel het supernatant in een centrifugebuis die is gelabeld met het elutienummer.

Herhaal dit proces drie keer en voeg vervolgens, om endotoxinen uit het SLO-eiwit te verwijderen, 200 µL gewassen poly mixing geconjugeerde agro beads, gesuspendeerd in res salt buffer, toe aan het monster en schud dit 30 minuten bij 4 °C. Centrifugeer vervolgens 1 minuut bij 10,000 ×g bij 4 °C. Verzamel na het centrifugeren het supernatant in nieuwe, gelabelde microcentrifugebuisjes.

Combineer 30 µL van elk eluaat met 10 µL SDS-monsterbuffer (vier keer geconcentreerd). Bewaar de SLO-oplossingen op ijs voor SDS-PAGE-analyse. Bepaal de proteïneconcentraties en de hemolytische activiteit; indien bevredigend, verdeel de SLOE in aliquots van 5 tot 10 µL, vries deze vervolgens in op droogijs en bewaar ze bij -80 °C.

Bepaal vervolgens de specifieke lysis. Reese. Suspendeer de te testen cellen in twee concentraties. Centreer de zes cellen per milliliter in buffer RB met 20 micrograms per milliliter.

Propidiumjodide. Hier worden T 27 A-cellen getest. Voeg in afzonderlijke microcentrifugebuisjes 100 µL cellen toe aan elke put van een 96-wells V-bodemplaat.

Verdun SLO via seriële verdunning tot twee keer de uiteindelijke concentratie in buffer rb. Voeg vervolgens ofwel 100 µL toxine of 100 µL buffer RB toe aan de cellen en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 °C. Typische uiteindelijke concentraties variëren van 2000 units per milliliter tot 31.25 units per milliliter.

Analyseer de cellen met een flowcytometer en verzamel gegevens met filters voor fi, cethrin of pe. Een verschuiving van één log staat voor tijdelijk permeabele cellen, terwijl een verschuiving van drie log duidt op dode cellen. Bereken de specifieke lysis van de cellen door het percentage dode cellen in de controle af te trekken van dat in de experimentele groep met behulp van de hier getoonde vergelijking; één dag voor de experimenten worden de five macrophages in tweevoud geplaatst op met collageen gecoat glas.

Schalen van 35 millimeter met een platte bodem. De microscoop die voor de toediening van het toxine wordt gebruikt, moet zijn uitgerust met een omgekeerde tafel, een verwarmde tafel, de juiste excitatie- en emissiefilterkubussen en, indien beschikbaar, een Bertrand-lens. Het moeilijkste deel van deze procedure is het intact naar de cellen brengen van de naald.

Om succes te garanderen, gebruiken we een Bertrandlens, die normaal gesproken voor uitlijning wordt gebruikt, om de naald te visualiseren terwijl we deze door de brandvlakken bewegen. De microscoop moet zijn aangesloten op een micro-injector en moet worden aangestuurd door een computer met voldoende geheugen om gegevens te verzamelen en op te slaan; schakel de microscoop en de micro-injector in en geef de verwarmde tafel de tijd om op te warmen tot 37 °C terwijl u wacht tot de tafel is opgewarmd. Label de cellen gedurende 30 minuten met kleurstof bij 37 °C.

Afhankelijk van de assay kan de labeling worden uitgevoerd met 5 µL, 4 of 2 µM in 1 mL HBSS of 2 µM calcium in 1 mL volledig medium; hier wordt 4 of 2 gebruikt. Verwijder het celmedium en was de cellen eenmaal met PBS. Aspireer de PBS en vervang deze door 1 mL RPMI aangevuld met 2 mM calciumchloride.

Plaats de schaal op de microscoop, breng de cellen in focus met brightfield en stel de focus vervolgens iets boven de cellen in. Meng daarna één µL SLO-toxine met vier µL DEXTRA 5 55 (10 mg/mL) en zes µL water. Centrifugeer dit vervolgens 10 minuten bij 20.000 ×g en 4 °C.

Dextran wordt gebruikt om te verifiëren dat de femto-tip niet verstopt is. Gebruik een micro-loader om twee microliters verdunde toxine vanaf de achterzijde in de femto-tip te laden. Plaats de femto-tip op de micro-injector.

Pas vervolgens de hoek van de injector aan zodat de tip boven het centrum van de cellen staat, met voldoende ruimte om in alle richtingen te bewegen. Wis de vorige instellingen voor de Z-limiet, die bepaalt hoe ver de tip van de micro-injector naar beneden kan gaan. Stel de micro-injector in om gedurende 0,5 seconden te injecteren bij 120 PSI met een tegendruk van 20 PSI. Laat de tip vervolgens zakken tot deze het medium binnendringt.

Gebruik de Bertrand-lens. Centreer de punt en volg de punt terwijl deze dichter naar de cellen wordt bewogen. Zodra de naald buiten focus raakt, schakelt u terug naar de normale optiek.

De schaduw van de naald moet zichtbaar zijn in het gezichtsveld. Stel scherp boven de cellen en laat de naald zakken tot deze scherp wordt gesteld. Breng vervolgens de cellen in focus en positioneer de naald voorzichtig naast een cel.

Nadat de Z-limiet voor de injectie is ingesteld, start u met de beeldvorming en injecteert u de toxine. Til vervolgens de naald op en verplaats deze naar een nieuw gebied met cellen. Injecteer extra toxine en ga na de injectie door met de beeldvorming.

Verplaats de naald naar de home-positie om ongewenste lekkage van toxine uit de naald te voorkomen met de methode die in deze video wordt beschreven, 10⁷ tot 10⁸ units per milliliter. SLO wordt doorgaans verkregen met een eiwitconcentratie van 4 mg/mL. Deze SDS-PAGE-gel toont bacteriële monsters voor en na toxine-inductie, evenals na zuivering, en elk van de drie elutiefracties; Coomassie-blauwkleuring onthult dat het geïnduceerde SLO succesvol is gezuiverd.

SLO is de band bij 69 kilodaltons om de hoeveelheid toxine te bepalen die nodig is voor lyse van T 27 A- of D-twee cellen. Cellen werden vijf minuten lang blootgesteld aan verschillende concentraties SLO bij 37 °C in aanwezigheid van propidiumjodide en vervolgens geanalyseerd via flowcytometrie. De specifieke lyse werd bepaald zoals hier wordt gedemonstreerd.

250 units per milliliter. SLO geeft 50% lysis van zowel T 27 A- als D-twee cellen. Een sublytische dosis toxine van 10% lysis zou 62,5 units per milliliter zijn.

Deze waarden zijn belangrijk als referentie voor de toxineactiviteit om celsterfte na blootstelling aan het toxine te beoordelen. Humane dermale fibroblasten werden geïncubeerd met calcium en atherium-homodimeer met behulp van een live-dead kit van Life Technologies. Na lokale blootstelling aan het bacteriële toxine, anthro lysine O. In deze afbeelding wordt calcium in het groen weergegeven en atheriumbromide in rode regio's dicht bij het microbioom, wat celsterfte aantoont gekenmerkt door calciumverlies en opname van athe-homodimeer, terwijl regio's verder van de punt verwijderd geen schade vertonen.

Micro-aflevering van de toxine maakt ook het onderzoek van real-time gebeurtenissen mogelijk, zoals calciumflux. Deze menselijke dcs geladen met 4:02 AM werden blootgesteld aan SLO bij een constante stroomsnelheid met gelijktijdige live-imaging; de verschuiving van groen naar blauw is zichtbaar. Pseudokleur geeft een toename van de cytosolische calciumgehaltes aan.

SLO induceert een snelle toename van cytosolisch calcium, die zich door het gebied van de schaal verspreidt als gevolg van de gelokaliseerde toediening. Echter, alleen cellen die zich dicht bij de tip van de micro-injector bevinden, komen in contact met en reageren op de toxine. Dit demonstreert zowel de cellulaire reactie op de toxine als het ruimtelijk beperkte gebied van de toxinetoediening om gebeurtenissen in de zdi-dimensie te onderscheiden.

Micro-aflevering werd gecombineerd met hogesnelheids 3D-confocale microscopie. Deze reeks beelden toont dendritische cellen na injectie van toxine. Deze waren vooraf geïncubeerd met anti-CD11c gekoppeld aan een PC, weergegeven in het groen, om het plasmamembraan te labelen.

Zoals hier te zien is, worden microvesikels vrijgegeven na de toediening van het toxine. Als onderdeel van het cellulaire herstelproces concentreren toxinemoleculen zich op blebs, die worden afgestoten om het toxine te elimineren. Zodra men dit beheerst, kan de microscopie in 45 minuten worden voltooid.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de toxine koud moet blijven voordat deze met de cellen wordt gemengd en dat de hemolytische activiteit moet worden getest. Goed. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de real-time kinetiek van immuuncelresponsen op bacteriële toxines kunt meten met behulp van live-cell microscopie.