Het gebruik van LysoTracker tot geprogrammeerde celdood detecteren in embryo's en differentiëren van embryonale stamcellen

Het doel van de volgende procedure is om aan te tonen hoe de lysosomen van twee soorten monsters, muizenembryo's en gedifferentieerde stamcellen, kunnen worden gekleurd met lyso tracker-kleurstof om patronen van celdood te detecteren. Om embryomonsters voor te bereiden, worden embryo's eerst chirurgisch geïsoleerd en in een schaaltje geplaatst om gedifferentieerde cellen voor te bereiden. Embryonale stamcellen worden gebruikt om embryolichamen te creëren.

Deze embryo-lichamen worden in suspensie gekweekt en vervolgens als monolaag op een kamerdia gegroeid. De embryo's in de monolaag kunnen worden geïncubeerd in LysoTracker Red en vervolgens worden gespoeld en gefixeerd; de monsters kunnen daarna worden gefotografeerd om de kleuringsresultaten te onderzoeken en te kwantificeren die LysoTracker tonen. Kleuring is een eenvoudige procedure die kan worden gebruikt om geprogrammeerde celdood in embryo's en gekweekte cellen te analyseren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals tunnel-analyse, is dat dik weefsel snel en eenvoudig kan worden geanalyseerd omdat OT-tracker-kleurstof een klein molecuul is. Hoewel deze methode inzicht kan geven in patronen van geprogrammeerde celdood in muizenembryo's en gedifferentieerde culturen, kan deze ook worden toegepast op andere weefseltypen, zoals kippenembryo's en differentiërende volwassen stamcellen. Plaats jonge vrouwelijke muizen bij een mannelijk dekdier en controleer de volgende ochtend op een vaginale prop, wat aangeeft dat de paring heeft plaatsgevonden.

Het middaguur op de dag dat de vaginale prop verschijnt, wordt effectief beschouwd als dag 0,5. Euthanaseer het vrouwtje volgens goedgekeurde protocollen op de embryonale dag van belang en verplaats de baarmoeder naar een Petrischaal van 10 centimeter met Hank's BSS en spoel al het bloed weg. Scheid de embryo's en verwijder ze uit de baarmoeder.

Verwijder de extra embryonale membranen en spoel ten minste één keer met Hank's BSS om vreemde weefsels en bloed te verwijderen. Houd de gedissecteerde embryo's op ijs tijdens het reinigen. De overige.

Bereid vijf milliliter Liso tracker embryo-kleuringsoplossing. Dit volume is voldoende voor één of twee embryo-collecties. Meng de oplossing voorzichtig om de kleurstof gelijkmatig te verspreiden, breng vervolgens de embryo's over naar de oplossing en incubeer ze gedurende 45 minuten bij 37 °C.

Spoel de embryo's na de incubatie voorzichtig vier keer gedurende vijf minuten per wasbeurt met Hank's BSS. Het is belangrijk om de spoelingen voorzichtig uit te voeren om beschadiging van het weefsel te voorkomen. Verwijder de vloeistof langzaam, waarbij u nauwlettend let op de positie van de delicate embryo's en er altijd voor zorgt dat er een deel van de vloeistof achterblijft om ze te bedekken.

Fixeer de embryo's vervolgens gedurende de nacht in 4% paraformaldehyde. Spoel de embryo's één keer gedurende 10 minuten met Hank's BSS om het fixatief te verwijderen. Dehydrateer de weefsels nu via een methanolserie om achtergrondkleuring te elimineren.

Deze stap verbetert de signaal-ruisverhouding tijdens de beeldvorming voorafgaand aan de opslag. Verzamel indien nodig een weefselmonster van elk embryo voor genetische analyse. Rehydrateer het weefselmonster later vóór het genotyperen.

Scheid de embryo's in individuele buisjes met labels die overeenkomen met het weefselmonster. De geïsoleerde embryo's kunnen nu onbeperkt worden bewaard in methanol bij min 20 °C. Bescherm tegen licht.

Begin met het voorbereiden van embryok lichamen via de hanging drop-methode. Met een startdichtheid van 500 cellen per druppel van 20 µL na drie dagen worden de embryolichesamen overgebracht naar suspensieculturen op niet-adherente Petri schalen van 10 cm. Kweek deze gedurende vijf dagen en ververs het medium elke twee dagen na deze eerste vijf dagen.

Breng de embryo-lichamen over naar gegelatiniseerde slides met acht kamers, waarbij één of twee embryo-lichamen in elke kamer worden geplaatst. Kweek de embryo-lichamen nog 10 dagen. Vervang na 10 dagen om de dag het medium door het bestaande medium voorzichtig af te zuigen en 300 µL Lyotracker-celkleuringsoplossing aan elke kamer toe te voegen.

Zorg ervoor dat u het medium handmatig pipetteert door de pipetpunt in de hoek van de kamer te plaatsen. Op deze manier verwijdert u niet per ongeluk de lichamen die nog bezig zijn zich aan het glasoppervlak te hechten. Plaats bij het opnieuw toevoegen van het medium de pipetpunt in de hoek van de kamer en voeg het medium zeer langzaam toe.

Incubeer de kamers 15 minuten bij 37 °C. Spoel ze vervolgens tweemaal met DPBS gedurende vijf minuten per spoelbeurt. Fixeer nu de cellen 15 minuten in 4% paraldehyde bij kamertemperatuur.

Verwijder vervolgens het fixeermiddel met DPBS in twee spoelingen van vijf minuten. Om de embryo's te monteren, plaatst u ze in een glasplaatje met een diepe uitsparing of een kleine Petri-schaal met infectiebescherming. Bereid de celmonsters voor op microscopie door de DPBS af te zuigen.

Verwijder de kamer van de objectglas en laat deze ongeveer vijf minuten aan de lucht drogen. Bedek met aluminiumfolie om de fluorescente kleuring te beschermen. Voeg vervolgens een waterig montage medium toe, zoals Vector Shield met DAPI, en plaats daarop een dekglas.

Nu is het objectglas gemonteerd en klaar voor beeldvorming. Visualiseer de monsters met een dissectiemicroscoop of een samengestelde microscoop die is uitgerust met een rhodamine- of Texas red-filter. De kleuring is doorgaans vrij helder, waardoor lange belichtingstijden in de handmatige modus meestal niet nodig zijn.

Maak digitale foto's van alle monsters onder dezelfde belichtingsomstandigheden. Om de beelden te kwantificeren, opent u deze in Adobe Photoshop of een vergelijkbaar beeldbewerkingsprogramma. Selecteer het rode kanaal om de hoeveelheid lyo tracker-kleuring te bepalen.

Noteer het aantal pixels voor de gehele afbeelding zoals weergegeven door de histogramfunctie. Pas vervolgens een drempelwaarde toe op de afbeelding, zodat de rode kleuring nu wordt weergegeven door witte pixels. Hiermee wordt de afbeelding omgezet naar zwart-wit.

Kies een drempelwaarde en gebruik dit niveau voor alle afbeeldingen in de set. Selecteer de witte pixels met de tool voor kleurbereik en gebruik de histogramfunctie om het totale aantal witte pixels te bepalen. Gebruik het blauwe kanaal om het aantal kernen in het gezichtsveld te tellen.

Het kan nuttig zijn om een overzicht van de telling bij te houden door de afbeelding te annoteren, de waarden te registreren en deze te gebruiken om het gemiddelde kleuringsniveau per cel te berekenen. Herhaal deze analyse met dezelfde drempelwaarde voor alle overige afbeeldingen. Om ly o tracker werd gebruikt om sonic hedgehog mutant embryo's te kleuren.

Aangezien ly O tracker een klein, zeer diffuseerbaar molecuul is, werden gebieden diep in het midden van een volledig embryo gekleurd op 10,5 dagen na de copulatie. Geprogrammeerde celdood (PCD) was sterk verhoogd in sonic hedgehog null-mutant embryo's, in het bijzonder in de ledematen en somietregio's. Lymknopjes werden in hele mounts bij een hogere vergroting afgebeeld om het algemene patroon te beoordelen. Gedisseceerde delen werden daarnaast gesneden met een vibratiermicrotoom.

De pijl wijst naar een toename van de kleuring in de distale punt van de sonic hedgehog-null secties verkregen met een cryostaat. TUNEL-kleuring werd in deze coupes gebruikt in combinatie met LysoTracker; hoewel er geen strikte één-op-één correlatie is tussen LysoTracker- en TUNEL-kleuring, overlappen de algemene regio's van PCD bij een hogere vergroting aanzienlijk. Het is mogelijk om puncta te zien die positief kleurden met de TUNEL-assay, maar niet met de LysoTracker-kleuring, puncta die alleen kleurden met de LysoTracker-kleuring, en puncta met overlappende kleuring. Na 10 dagen embryonale lichaamskweek differentieerden de cellen in een verscheidenheid aan celtypen, waaronder neuronen, spiercellen en cardiomyocyten.

In de normale kweek van gedifferentieerde ES-cellen zijn er enkele cellen die PCD ondergingen, zoals aangetoond met lyo tracker- en tunnel-assays. Vervolgens werden de cellen behandeld met waterstofperoxide om celdood door oxidatieve stress op te wekken. Een lage dosis waterstofperoxide verhoogde zowel de lyo tracker- als de tunnel-kleuring in vergelijking met de groep zonder behandeling.

Vergelijkbaar met de resultaten in het embryo labelden beide kleuringen zowel gemeenschappelijke als unieke cellen. Een hoge dosis waterstofperoxide resulteerde in celkrimp en een meer wijdverspreide positiviteit voor de OT-tracker en tunnel. Ter vergelijking werd serumuithongering gebruikt om autofagie te induceren na één uur serumuithongering.

De kleuring van de OT-tracker nam toe. De TUNEL-positiviteit bleef echter op normale niveaus. Hoewel reer dus eenvoudig en nuttig is, is het belangrijk om na het kwantificeren van de monsters aanvullende assays uit te voeren om te bepalen of de kleuring wijst op apoptose of autofagie.

Met de eenvoudige Photoshop-methode die eerder werd gedemonstreerd, bevestigden de resultaten dat toenemende concentraties waterstofperoxide leidden tot een hoger niveau van lys tracker-kleuring. Zodra deze procedure onder de knie is, kan de kleuring in minder dan twee uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals NX-5 of lc-3 immuunkleuring, worden toegepast om het type celdood te bevestigen. Houd er rekening mee dat TrackER Green momenteel alleen werkt op levende cellen, waardoor TrackER Red de beste optie is voor monsters die fixatie vereisen.