Iteratieve optimalisatie van DNA-duplexen voor kristallisatie van SeqA-DNA complexen

Dit experiment beschrijft in detail hoe diffractiekwaliteitskristallen kunnen worden verkregen van een eiwit gebonden aan DNA dat een tandem hemi-gemethyleerde GATC bevat. Herhalingen worden gebruikt om de kristalpakking van het eiwit-DNA-complex te bevorderen. Begin met het rationele ontwerp van de DNA-lengte, de GATC-afstand en de DNA-uiteinden, ga verder met de complementaire enkelstrengse oligonucleotiden om het DNA te zuiveren en vervolgens te annealen om de hemi-gemethyleerde DNA-duplex te vormen, en meng daarna de gezuiverde seq A erbij om het complex te vormen.

Bepaal vervolgens de optimale omstandigheden voor het kweken van diffractiekwaliteitskristallen van het eiwit-DNA-complex met crystallisatiedisplays met behulp van commerciële sparse matrix screens. Gedemonstreerde resultaten. Deel het effect van variërende DNA-lengte, GATC-afstand en uiteinden op de diffractiekwaliteit van de CQ A DNA-kristallen.

Het doel van dit werk is om kristallen van CK gebonden aan DNA van diffractiekwaliteit te verkrijgen, maar het kan ook helpen om de algemene variabelen te begrijpen die in overweging moeten worden gebracht bij het ontwerpen van DNA-duplexen voor de kristallisatie van andere eiwit-DNA-complexen; de demonstratie van deze procedure zal worden gebruikt in Chang, A, een promovendus uit mijn laboratorium. Deze studie maakt gebruik van een variant van de DNA-replicatieregulatie-eiwitten. Zoek een variant die stabiele dimeren vormt en een verkorte linkerregio heeft tussen zijn oligomerisatie- en DNA-bindingsdomeinen.

Deze variant beperkt de DNA-binding tot tandem GATC-herhalingen die uitsluitend door één winding op het DNA gescheiden zijn. Transformeer eerst BBL 20 1D drie cellen met het plasmide dat DEMETRIC seq A codeert onder controle van de T7-promotor. Plaats de transformatiereactie op LB-agarplaten die 100 µg/mL ampicilline bevatten en zet deze overnacht in de bacteriële incubator. Selecteer gemengde koloniën en start een overnight-cultuur op kleine schaal.

Inoculeer de volgende ochtend één liter cultuur met 10 milliliters van het overnacht gekweekte inoculum. Wanneer de cultuur zich in de log-fase bevindt, voegt u twee milliliters 0,5 molar IPTG toe om de eiwitproductie te induceren. Zet de incubatie drie uur voort in een orbitale schudkerf bij 37 °C.

Oogst vervolgens de cellen door centrifugatie bij 3.300 G gedurende 10 minuten. Resuspendeer de celpellet in zuiveringsbuffer, lysis door sonicatie en klaarte het lysaat door centrifugatie bij 39.000 ×g gedurende 40 minuten. Laad nu de supernatant op een met zuiveringsbuffer geëquilibreerde heparinekolom.

Om het CK-eiwit te elueren. Gebruik een lineaire gradiënt naar één molair natriumchloride; het CK-eiwit elueert bij ongeveer 0,7 molair natriumchloride. Verzamel de CK-bevattende fracties en verdun deze om de ionsterkte van het monster te verlagen.

Laad vervolgens het monster in een kationenuitwisselingschromatografiekolom die is geëquilibreerd met purificatiebuffer. Pas een lineaire zoutgradiënt toe om puur CK-eiwit te elueren bij ongeveer 0,4 molar natriumchloride. Combineer de CK-bevattende fracties.

Concentreer tot drie milligram per milliliter en bewaar in de opslag. Bufferontwerp van complementaire ongemethyleerde en gemethyleerde oligonucleotiden. Bereid monsters voor van één micromol van elk gelyofiliseerd enkelstrengs DNA in 800 microliters geautoclaveerd, dubbel gedestilleerd water, vortex en laat 15 minuten staan, en 800 microliters.

Voeg voor oligonucleotiden met een lengte van 20 tot 30 nucleotiden twee keer voorverwarmde laadbuffer toe aan elk monster en bereid een grote denaturerende gel van 10% voor. Verwijder na polymerisatie de kam en spoel de wells grondig uit. Assembleer de gel door de bovenste en onderste reservoirs te vullen met één keer TBE-runbuffer.

Voer een voorloop uit op de gel bij 750 volt om de gel op te warmen tot 55 °C. Stop vervolgens de run en spoel de wells grondig uit met run-buffer. Verhit nu de oligonucleotiden gedurende twee minuten tot 90 °C.

Vortexen en centrifugeren. De monsters worden direct gebruikt voor het laden van de gel. Laat de gel lopen op ongeveer 700 volt totdat het oligonucleotide is gemigreerd.

Halverwege een 10% polyacrylamidegel co-migreert alph phenol blue met oligonucleotiden van ongeveer 20 basen lang en xylene syl ff met oligonucleotiden van ongeveer 60 basen lang. Demonteer de gel uit het apparaat en verwijder de afstandhouders op een vlak oppervlak. Verwijder één glasplaat en dek de gel af met vershoudfolie.

Draai vervolgens de gel om, verwijder de andere glasplaat en dek de gel af met vershoudfolie. Markeer daarna de banden met UV-licht en een fluorescerende plaat achter de gel. Om de DNA-schaduw met een scheermesje te kunnen zien, snijdt u de band uit en verdeelt u deze in kleine stukjes.

Breng elk monster over in een steriele buis van 15 milliliter. Voeg negen milliliter elutiebuffer toe en verdun dit gedurende de nacht bij 37 °C onder agitatie. Breng de oplossing voorzichtig over naar een autoclaafcentrifugebuis met behulp van een gel-laadpipetpunt.

Om te voorkomen dat er acrylamidefragmenten worden overgedragen, voegt u 1 mL 3 mM natriumacetaat bij pH 7 toe, plus 25 mL gekoelde 100% ethanol, en incubeert u dit gedurende ten minste drie uur bij -20 °C. Centrifugeer het neersla de DNA. Droog vervolgens de pellets in de speed vac bij medium hitte, resuspendeer elke pellet in 400 µL geautoclaveerd, dubbel gedestilleerd water en breng deze over naar een nieuwe buis.

Voeg 40 µL natriumacetaat 3 M bij pH 7 en 1 mL 100% ethanol toe, vortex en incubeer 30 minuten bij -20 °C. Centrifugeer vervolgens 15 minuten bij 18.000 ×g. Spoel de DNA-pellets met 100 µL koude 70% ethanol om eventuele resterende zouten te verwijderen en centrifugeer zes minuten bij 18.000 ×g. Verwijder daarna de ethanol en droog de pellet in een SpeedVac.

Resuspende nu elk pellet in 100 µL autoclaaf-dubbel gedestilleerd water. Bepaal de concentratie van de oligonucleotiden via spectrometrie. Om de hemi-gemethyleerde DNA-duplexen te bereiden, mengt u eerst gelijke molaire concentraties van de complementaire enkelstrengse fragmenten.

Verwarm de mengsels vervolgens vijf minuten lang in een waterbad tot 95 °C om de strengen te denatureren. Laat de monsters langzaam afkoelen tot kamertemperatuur in het waterbad. Combineer gelijke volumes van 81 µM gezuiverd CQ a-eiwit en 81 µM hemigemetyleerd DNA.

Incubeer vervolgens 15 minuten bij kamertemperatuur. Bewaar bij vier graden Celsius tot gebruik; screen voor kristallisatiecondities met behulp van commerciële sparse matrix screens. Zodra de initiële kristallisatie-leads zijn geïdentificeerd, kunnen de condities worden geoptimaliseerd om kristallen van diffractiekwaliteit te laten groeien. Cryoprotegeer de resulterende CK DNA-kristallen.

Verhoog ofwel de hoeveelheid PEG 400 in de crystallisatieloplossing tot een eindconcentratie van 25% of voeg 20% glycerol toe aan de crystallisatieloplossing. Schep individuele kristallen op met een nylon loop flash. Bevries de monsters in vloeibare stikstof.

Test nu de diffractielimiet van elk kristal bij 100 k. Om de kristalstructuur te verkrijgen van de verkorte mutant van CK gebonden aan hemi-gemethyleerd DNA, optimaliseren we opeenvolgend drie parameters van het DNA: de afstand tussen hemi-gemethyleerde GATC-sequenties, de lengte van de duplex en de afwezigheid of aanwezigheid van 5'-overhangs. Deze studie maakt gebruik van een DME-variant van seek a met een puntmutatie in het eindterminale domein die verdere ligamentisatie voorkomt en een verkorte linker die DNA-binding beperkt tot tandem.

GATC-herhalingen gescheiden door precies één winding in de DNA-electrophoretische mobiliteitsshift-assays wijzen erop dat het gemodificeerde CK-eiwit bij voorkeur bindt aan GATC-herhalingen die gescheiden zijn door negen tot 10 basenparen. Daarom maken de initiële screenings gebruik van duplexen van 23 tot 24 basenparen lang die twee hemigemethyleerde GATC-herhalingen bevatten, gescheiden door negen of 10 basenparen.

Drie duplexen leverden mooi gevormde kristallen op. Hoewel geen van de kristallen diffractie tot een hoge resolutie vertoonde, gaven de gegevens aan dat een A-G-A-T-C scheiding van negen baseparen bij voorkeur leidde tot kristallisatie; het onverwacht versterken van de interacties tussen de groef en het ruggengraat door een CG-dinucleotide tussen de twee GATC-plaatsen op te nemen, veranderde de diffractielimiet van de kristallen niet.

In tegenstelling hiermee veranderde het optimaliseren van de lengte van de overhangs de moleculaire contacten en de kristalmorfologie drastisch. De kristalstructuur van dit CK-eiwit gebonden aan een hemigemetyleerde DNA-duplex bevestigde dat het vrije vlak van de DNA-duplex niet betrokken is bij kristalcontacten ondanks de relatieve grootte van het eiwit en het DNA; de meeste interacties tussen symmetriepartners worden gemedieerd door eiwit-eiwit- en eiwit-DNA-interacties. Interessant is dat in dit specifieke geval het gunstige effect van een 5'-dinucleotide-overhang niet te wijten is aan de vorming van een pseudocontinu DNA.

In plaats daarvan steekt het 5'-uiteinde van de gemethyleerde streng weg van de DNA-assen en interageert het met het proximale CK-molecuul van het complex, wat verklaart waarom twee nucleotiden strikt noodzakelijk waren om de kristalpakking te veranderen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u eiwitten zuivert en DNA-duplexen ontwerpt voor de kristallisatie van eiwit-DNA-complexen. Het is belangrijk om te onthouden dat, hoewel dit protocol is ontwikkeld om het CK-DNA-complex te kristalliseren, de rationele optimalisatie van de DNA-lengte, sequentie en uiteinden een algemeen kader biedt voor het ontwerpen van DNA-duplexen voor de kristallisatie van andere eiwit-DNA-complexen.