Monitoring Plasmide Replicatie in Live zoogdiercellen over meerdere generaties door fluorescentie microscopie

Het algemene doel van deze procedure is om de verdeling van virale genomen in delende cellen te observeren. Dit wordt bereikt door eerst een plasmide te maken dat via fluorescentiemicroscopie kan worden gevisualiseerd. Hierbij wordt een plasmide ontwikkeld dat tandemherhalingen van de lactose-operatorsequentie of LAC O bevat. De tweede stap is het introduceren van het plasmide in delende cellen, gevolgd door infectie van de cellen met een retrovirus dat de lactose-repressor of lac I codeert, gefuseerd aan een fluorescent eiwit.

De lactose-repressorfusie-eiwitten zullen specifiek binden aan de lactose-operatorsequenties in het plasmide sub. De cellen worden gecontroleerd met fluorescentiemicroscopie om individuele plasmiden door meerdere celcycli heen te volgen. Uiteindelijk worden de verkregen beelden verwerkt om vast te stellen hoe de virale genomen in delende cellen worden behouden.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals kwantitatieve PCR, Southern blotting of fluorescentie in situ hybridisatie, is dat deze techniek het mogelijk maakt om individuele plasmiden op meerdere tijdstippen te observeren. Om visualisatie van het plasmide via fluorescentiemicroscopie mogelijk te maken, worden standaard moleculaire kloneringstechnieken gebruikt om een DNA-fragment dat ongeveer 250 kopieën van de lactose-operatorsequentie of LAC O bevat, in het plasmide te introduceren. In dit voorbeeld is het plasmide een BAC-mid van ongeveer 170 kilobaseparen dat het volledige genoom van het Kaposi-sarcoom-geassocieerde herpesvirus of KSHV bevat en resistentie tegen hygromycine codeert.

Introduceer het LAC O dat plasmid DNA bevat in HeLa- en SLK-zoogdiercellen via transfectie. Incubeer de cellen in schalen van 60 millimeter met 10 micrograms gezuiverd plasmid-DNA, 25 microliters Lipofectamine 2000, 0,5 milliliters Opti-MEM en 3,5 milliliters DMEM gedurende vier uur. Vervang het medium door DMEM met 10% foetaal runderserum en laat de cellen 48 uur herstellen.

Zaai vervolgens de getransfecteerde cellen met een lage dichtheid uit in grote schalen en kweek deze drie weken in DMEM met 10% foetaal runderserum en 300 micrograms per milliliter hygromycine om selectie voor het geïntroduceerde plasmide uit te voeren; gebruik stukjes steriele tips en geweekt filterpapier om hygromycine-resistente kolonies over te brengen naar nieuwe kweekschalen. Plaats de schalen in de incubator. Na één tot twee weken, wanneer de getransfecteerde klonen zijn gegroeid tot ze de schaal vullen, wordt DNA geïsoleerd voor restrictiedigestie en southern blotting om te bevestigen dat het polymeer van het LAC O-plasmide homogeen is en de verwachte grootte heeft. Deze voorbeeld-blot laat zien dat het LAC O-polymeer in kloon één homogeen is en identiek is aan dat van de positieve controle.

In baan zeven, indien het plasmide niet is ontwikkeld om een fusie van de lactose-repressor lacI te expresseren, infecteer geschikte klonen dan met een retrovirus dat lacI codeert, gefuseerd aan een rood fluorescent eiwit zoals tdTomato. tdTomato is gekozen in plaats van eiwitten die dichter bij groen fluoresceren om fototoxiciteit te minimaliseren die zou optreden bij meerdere belichtingen over lange perioden. Zodra het lacI-fusie-eiwit is geïntroduceerd, kweek de cellen in de aanwezigheid van 200 µg/mL IPTG om te voorkomen dat de fusie-eiwitten aan het DNA binden. Een van de meest kritische aspecten van deze procedure is het verkrijgen van klonen met de juiste fluorescentie-intensiteit.

Een groot aantal klonen moet worden gescreend om die met de optimale fluorescentie te identificeren. Kweek de cellen gedurende ten minste drie dagen om expressie van het LAC eye TD tomato-eiwit mogelijk te maken; screen de klonen op die met optimale niveaus van lac eye, TD tomato die duidelijke signalen geven met minimale achtergrondniveaus van ongebonden fusie-eiwit. Plaats de LAC I TD tomato-expresserende cellen 24 tot 48 uur voor beeldvorming in een glazen bodemschaal van 35 millimeter bij een dichtheid van minder dan 10% confluentie. Dit stelt paren cellen in staat om zich één tot drie uur voor aanvang van de beeldvorming te delen in kolonies van acht tot 16 cellen zonder elkaar te overlappen.

Spoel de plaat drie keer met kweekmedium dat geen selectieve geneesmiddelen en geen IPTG bevat. Dit wast niet-levensvatbare cellen weg en stelt de lac eye-fusie-eiwitten in staat om aan de LAC-cyten in de plasmiden te binden. Vervang het kweekmedium door twee milliliter DMEM met 10% foetaal runderserum en 25 millimolair Hippies; incubeer gedurende één tot drie uur. Vervang vlak voor de beeldvorming de bovenkant van de kweekschaal door cult-folie die is gespannen in een montage ring voor een 35 millimeter schaal.

Deze afdekking voorkomt verdamping van het kweekmedium, wat na verloop van tijd de zoutconcentratie zou verhogen en de cellen zou doden. Het beeldvormingssysteem dat in dit experiment wordt gebruikt, bestaat uit een Zeiss Axio 200 M omgekeerde microscoop, uitgerust met een gemotoriseerde tafel en een EM CCD-camera voor gevoelige detectie van signalen. Fluorescentie-excitatielicht wordt geleverd door de neutrale witte LED van een Collibra-systeem.

Het beeldsysteem wordt aangestuurd door software voor geautomatiseerde acquisitie van beelden over langere tijdsintervallen met meerdere Z-stacks. Er wordt een incubator op het objecttafel gebruikt om de cellen op 37 °C en vijf tot 10% koolstofdioxide in een bevochtigde kamer te houden. Gebruik een verwarmde kraag voor het olie-objectief om te voorkomen dat het objectief gaat siphoneren.

Verwarm het monster en laat het systeem voldoende tijd hebben om een stabiele temperatuur te bereiken. Om bewegingsartefacten tijdens het experiment te minimaliseren, dient het imagingsysteem op een luchttafel te staan om trillingen te isoleren. Om de procedure voor het visualiseren van gelabeld DNA te starten, wordt DIC-imaging gebruikt om de cellen te bekijken en het brandvlak van de boven- en onderkant van de cellen in meerdere gezichtsvelden te bepalen; ga in elk veld naar een brandvlak dat ongeveer een derde van de bovenkant van de cel naar beneden ligt en sla de x, y, Z-coördinaten op in de lijst met opgeslagen tafelposities.

Elke van deze opgeslagen posities zal het centrum vormen van een Z-stapel afbeeldingen om de cel vast te leggen in de software voor microscoopbesturing; definieer een Z-stapel afbeeldingen die bij elke opgeslagen fasepositie moet worden uitgevoerd en definieer voldoende coupes zodat de gehele cel wordt vastgelegd, inclusief extra coupes boven en onder de vlakken waarin de cellen zich bevinden. Kies een Z-stapgrootte van 0,35 tot 0,50 microns om een benadering van Nyquist-sampling in de Z-dimensie mogelijk te maken. Deze coupes maken detectie mogelijk na celbewegingen tijdens de celcyclus en worden ook gebruikt bij de nabewerking van de afbeeldingstacks na acquisitie.

Dit resulteert in een stapel van 40 tot 60 beelden, afhankelijk van de dikte van de cellen. Definieer een tijdserie-experiment om elke 30 minuten een brightfield-beeld van de Zacks te verzamelen en fluorescentiebeelden met intervallen van 10 tot 60 minuten. Gebruik tijdens het experiment geen DIC-beeldvorming, omdat dit meer licht vereist dan standaard brightfield-beeldvorming, waardoor de cellen gedurende lange experimenten onnodig worden blootgesteld aan fototoxiciteit.

Start het softwaregestuurde experiment. Zorg ervoor dat het systeem tijdens het experiment niet wordt gestoord. Nadat alle beelden voor het experiment zijn verkregen, beoordeelt u de beelden voor elke Zack en elk tijdstip en snijdt u eventuele onnodige delen van de beelden weg om de computeraverwerkingstijd te verkorten.

In de volgende stap wordt de signaalintensiteit opnieuw toegewezen aan de pixel van oorsprong in elke Z-stack. Gebruik hiervoor een deconvolutie-algoritme in de Axio vision-software, gebaseerd op de gemeten point spread function van het beeldvormingssysteem. Het resultaat van de deconvolutie wordt hier getoond.

Bestudeer de afbeeldingen om de intensiteitsveranderingen en bewegingen van plasmiden tijdens de celcyclus en de verdeling van plasmiden over de dochtercellen te volgen. Deze afbeeldingen, die computationeel zijn samengesteld om meerdere Z-vlakken te bevatten waarin de verschillende signalen zich bevinden, laten zien dat de kernen van HELOC-cellen die LAC eye TD tomato tot expressie brengen fluorescent zijn vanwege het nucleaire lokalisatiesignaal op het fusie-eiwit, dat het in de kern lokaliseert. In afwezigheid van I-P-T-G-K-S-H-V rekruteren genomen die LAC O-sequenties coderen vele kopieën van het fluorescente eiwit en vallen op als heldere signalen boven de achtergrondintensiteit van de kern.

In tegenstelling hiermee wordt in aanwezigheid van IPTG voorkomen dat de LAC eye fluorescerende eiwitten binden aan hun herkennings-lack O-sequentie; maximale intensiteitsprojecties van Zack zijn verkregen van een celcyclus op vijf tijdstippen. De resultaten van een representatief experiment worden in deze figuur getoond. De fluorescentie-gelabelde virale genomen in de cel die zichtbaar is in paneel A worden gesynthetiseerd zoals getoond in paneel B. De virale genomen worden vervolgens tijdens de celdeling verdeeld over de dochtercellen, zoals waargenomen in paneel C, D en E. De celcyclus voor gezonde HELOC-cellen duurt ongeveer 24 uur, en dochtercellen hechten doorgaans vlak bij elkaar aan en delen zich in de volgende celcyclus op hetzelfde moment.

Met dit protocol kunnen de virale genomen in de cel over meerdere generaties worden gevolgd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de celmorfologie gedurende de generatietijd in de gaten te houden om er zeker van te zijn dat de cellen gedurende het gehele experiment gezond blijven.