Kwantitatieve meting van de immuunrespons en Sleep in

Het algemene doel van het volgende experiment is om de slaap en immuunfunctie bij drosophila te evalueren. Dit wordt eerst bereikt door de locomotorische activiteit van geïnfecteerde vliegen te registreren om de slaap te meten, en als tweede stap, na de infectie, worden de vliegen gehomogeniseerd, verdund en uitgeplaat op LB-agarplaten om de overleving te meten. Het aantal kolonievormende eenheden dat groeit, geeft de capaciteit van de vliegen aan om de infectie te klaren.

Vervolgens worden geïnfecteerde vliegen die een transgen bevatten met de NF kappa b luciferase-reporter toegevoegd aan een 96-wells plaat met luciferian, het substraat van luciferase. Real-time meting van kappa b Luciferase duidt op de activatie van een NF kappa B-signaleringsroute tijdens infectie en de uiteindelijke overleving tijdens de slaap. Bacteriële klaring en NF KB reporteractiviteit zijn metingen die mechanistisch inzicht bieden in de moleculaire link tussen immuunfunctie en gedrag.

Over het algemeen hebben personen die nieuw zijn aan deze methode moeite ermee, omdat het tijd en oefening kost om te leren hoe vliegen handmatig en consistent geïnfecteerd kunnen worden. Het belangrijkste voordeel van de door Lucifer gerapporteerde techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals QPCR is dat NF Kappa B-activiteit continu in real-time in levende vliegen gemeten kan worden. Begin met het incuberen van Drosophila-culturen in het late popstadium gedurende drie tot vier dagen, zodat de volwassenen kunnen wennen aan de omgevingscondities.

Hier worden de vliegen onder constant licht geplaatst om de invloed van de circadiane klok op de immuunrespons en het gedrag te elimineren. Laad vervolgens vliegen van één tot vier dagen oud in de activiteitsmonitoren. De monitoren registreren hun activiteit gedurende minimaal drie dagen voorafgaand aan de infectie, tot één dag voor de geplande infectie.

Select een enkele SIA-kolonie met een steriele pipetpunt en dompel de punt in een cultuurbuis met vijf milliliters LB-medium om de steriele techniek te verifiëren. Vergeet niet een controle-mockcultuur zonder bacteriën aan te maken. Laat de bacteriën overnight groeien totdat ze de volgende dag de exponentiële groeifase bereiken.

Meet de absorbentie van de cultuur bij 600 nanometer. Gebruik een tweede Q vet als blanco. De cultuur is klaar voor subcultuur wanneer de concentratie tussen 0,5 en 1 absorbentie-eenheid ligt, of verleng de incubatietijd indien nodig.

Bereid nu de bacteriële oplossing voor om de vliegen te infecteren. Verdun de bacteriën met PBS tot een verwachte absorbentie van 0,1 bij 600 nanometer. Voeg vervolgens kleurstof voor levensmiddelen toe voor de injectiecontrole.

Vervang de bacteriën door LB-medium. Bewaar beide oplossingen op ijs. Maak vervolgens met een micropipet-trekker injectienaalden met een fijne punt onder een dissectiemicroscoop.

Gebruik een fijne pincet om de punt van elke naald af te breken, zodat de opening groot genoeg is om met zuigkracht te vullen met injectievloeistof, maar klein genoeg om schade aan de vlieg te minimaliseren. Bevestig een glazen naald met een stukje slang aan een plastic spuit van drie cc. De stroom van het injectiemedium wordt handmatig geregeld.

Voorkom contaminatie van de rubberen slang met injectievloeistof, aangezien de spuitenapparatuur wordt gebruikt voor zowel infectieuze als controle-injecties. Controleer de doorstroming van het injectiemedium met een Kimwipe-doekje. Twee cruciale details voor succesvolle injecties zijn het gebruik van de optimale naaldmaat en een goede afdichting tussen de naald en de spuit.

Zodra het injectiesysteem volledig is voorbereid, worden de vliegen genestheseerd met een minimale stroom koolstofdioxide; werk vlot zodat geen enkele vlieg langer dan vijf minuten is genestheseerd. Injecteer de vliegen vervolgens door de glazen naald in het gebied boven het scutellum van de dorsale thorax te steken. De passage van het injectiemedium in de vlieg wordt geverifieerd door de kleurstof, die zichtbaar wordt wanneer de geïnjecteerde oplossing zich verspreidt.

Zorg er vóór aanvang voor dat alle materialen die voor deze procedure worden gebruikt, ten minste een dag van tevoren zijn geautoclaveerd. Bereid petri-schalen van 10 centimeter voor met LV-agarmedium. Anestheseer de vliegen op de dag van het experiment en plaats ze in centrifugebuisjes van 1,5 milliliter.

Bereid per experimentele conditie minimaal twee groepen van elk 10 vliegen voor. Bereid daarnaast een controlegroep vliegen zonder infectie voor, vooral bij gebruik van een bacteriële stam zonder antibioticaresistentie. Bewaar alle gevulde buisjes op ijs.

Voeg vervolgens 400 µL LB-medium toe aan elke buis met vliegen. Homogeniseer de vliegen met een kleine parel en doe dit in de buurt van een vlam om contaminatie te voorkomen. Gebruik nu de afgeknotte pipetpunten om het homogenaat in volumes van 200 µL in stappen van factor 10 seriële verdunningsreeksen te maken.

Indien het homogenisaat direct na infectie met sia wordt bereid, maak dan verdunningen tot 1:1000; voor homogenisaat 24 uur na infectie worden verdunningen tot 1:100.000 gemaakt. Zaai vervolgens de twee grootste verdunningen uit op platen van 10 centimeter met behulp van glasparels om een gelijkmatige distributie te garanderen en incubeer de platen een nacht. Tel de volgende dag het aantal kolonies op de plaat door directe observatie of via software voor kolonietelling.

Bereken vervolgens het aantal kolonievormende eenheden per vlieg. Deze assay maakt gebruik van transgene vliegen die de kappa b luciferase reporter dragen op het juiste tijdstip. Voor de assay zijn ook gekweekte bacteriën nodig, zoals SCIA, die voor injectie zijn voorbereid zoals beschreven in de vorige sectie.

Wen de vliegen aan de experimentele lichtomstandigheden. In dit voorbeeld worden één tot vier dagen oude kappa b luciferase-vliegen gehuisvest in vials met een voedingsmedium van 5% sucrose en 2% agar, en gedurende twee dagen blootgesteld aan constant licht. Bereid nu een 96-wells microplaat voor de vliegen voor.

Vul elke put met twee lagen voedingsmedium. Voeg eerst 300 µL van een 5% sucrose, 2% agar-oplossing toe aan elke put. Dek de plaat af met een fijnmazige doek en laat de plaat tot een uur grondig drogen.

Voeg vervolgens aan elke put een bovenlaag van 50 µL toe bestaande uit 5% sucrose, 1% agar en 2 mM Lucifer. Omdat Lucifer lichtgevoelig is, moet de plaat in het donker worden gedroogd; minimaliseer vanaf dit punt de blootstelling van de plaat aan licht.

Zodra de agar is afgekoeld, wordt de plaat bedekt met een transparante plakfolie. Perforeer vervolgens de folie met een fijne naald twee keer boven elke put. Deze gaatjes maken luchtuitwisseling en gasvormige anesthesie mogelijk.

Gebruik vervolgens een scherp mesje en een liniaal om inkepingen tussen elke kolom aan te brengen, zodat de vliegen gemakkelijker kunnen worden overgeplaatst. Narcoseer de vliegen met kooldioxide en plaats ze één voor één in elk putje, kolom voor kolom. Mocht een vlieg aan de folie blijven plakken, geef deze dan de gelegenheid om zichzelf te bevrijden voordat u ingrijpt.

Plaats de micro-wellplaat gedurende acht tot 24 uur terug in de incubator onder constant licht. Om de in de wells gebonden vliegen te anesthetiseren, gebruikt u een micropipetpunt die is aangesloten op een koolstofdioxideleiding met lage druk. Zorg ervoor dat het gas een onschadelijk lage druk heeft en plaats de micropipetpunt direct boven de ventilatiegaten om vliegen in groepen van acht individueel te anesthetiseren.

Breng elke vlieg over naar een CO2-pad en infecteer ze met bacteriën zoals eerder beschreven. Plaats vervolgens elke vlieg terug in de oorspronkelijke well en verzegel de microplaat opnieuw. Meet de luminescentie in elke vlieg met een luminometer in een temperatuurgecontroleerde ruimte volgens een vastgesteld lichtschema.

Plaats de platen in de stapelcassette en zorg ervoor dat de platen met de vliegen tussen heldere lege platen worden gestapeld. Programmeer de luminometer volgens de specificaties van de fabrikant en verzamel elk uur metingen gedurende minimaal 24 uur. In dit voorbeeld zijn de detectoren zo geprogrammeerd dat ze elke well gedurende 10 seconden uitlezen.

Zodra dit is voltooid, exporteert u de databestanden naar een spreadsheet en voert u een standaardanalyse uit door de resultaten in een grafiek weer te geven. De voorbeeldgegevens kunnen worden geanalyseerd. Kortingen per seconde zijn gemiddeld over drie metingen per putje.

Canton S wild-type vliegen en relish. E 20 mutantvliegen met een deficiëntie in het NF kappa B-gen werden geplaatst in twee activiteitsmonitoren bij constant licht en geïnfecteerd met sia. In dit voorbeeld stimuleerde de infectie de slaap.

Het was duidelijk dat relish E 20-mutanten minder sliepen dan Canton s-controlevliegen na infectie. In overeenstemming met eerdere bevindingen bezweken de relish E 20-mutanten ook sneller aan de infectie in vergelijking met wild-typevliegen.

De meeste vliegen overleefden de aseptische controle-injectie, wat aangeeft dat de vliegen bezweken aan de infectie en niet aan het letsel door de injectie. Omdat de relish-mutanten zo snel stierven, werden alleen Canton s-vliegen gebruikt om de bacteriële load na infectie aan te tonen. Sia bleef prolifereren in de vlieg 24 uur na de infectie.

De reporteractiviteit van Lucifer vertoonde een grote variatie tussen individuele vliegen en tussen opeenvolgende datapunten. Hoewel het signaal afkomstig is van alle weefsels in de vlieg, wordt er niet verwacht dat elk weefsel dezelfde hoeveelheid signaal afgeeft, en de zichtbaarheid van het weefsel voor de detector varieert naarmate de vlieg beweegt. In dit voorbeeld werden vliegen geïnfecteerd en vergeleken met een gehanteerde controlegroep.

Vliegen die stierven werden uitgesloten van de analyse binnen een groep vliegen. De Kappa b Luciferase-reporteractiviteit stijgt gestaag na infectie. De activiteit van de Kappa b Luciferase-reporter steeg ook gestaag na aseptisch letsel.

De piekactiviteit lag rond de 12 uur, zowel na het letsel als na de infectie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de immuunfunctie en slaap in SSO na infectie kunnen worden gekwantificeerd. We kunnen slaap, overleving, tijd, bacteriële klaring en de real-time activiteit van een un copy transcriptie-reporter meten.