Kwantitatieve Locomotion Studie van Vrij Zwemmen micro-organismen met behulp van laser diffractie

Het algemene doel van deze procedure is om de thrashing-frequenties van vrijzwemmende microscopische organismen te meten. Dit wordt bereikt door eerst een monster van microscopische wormen voor te bereiden. Vervolgens wordt de optische opstelling klaargemaakt.

Vervolgens wordt het diffractiepatroon dat door de levende organismen wordt veroorzaakt, geregistreerd. Ten slotte worden de geregistreerde gegevens geanalyseerd om de zwemfrequenties te bepalen. Uiteindelijk wordt diffractieanalyse gebruikt om veranderingen in de bewegingspatronen van ongebonden wormen aan te tonen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals traditionele microscopie, is dat zwempatronen kunnen worden waargenomen terwijl de soort zich vrij beweegt in een driedimensionale ruimte. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in vrij zwemmende C. elegans, kan deze ook worden toegepast op andere transparante, kleine en microscopische organismen die aan verschillende omstandigheden worden blootgesteld. Om C. elegans klaar te maken voor videoanalyse, begint u met het verplaatsen van 10 tot 20 volwassen nematoden naar verse NGM met behulp van een platgedrukt platina-draadpick.

Agar-gevulde Petri-schalen met kleine cirkelvormige vlekken van e coli. Laat de nematoden drie tot vijf uur lang eieren leggen en verwijder vervolgens de volwassenen. Zo wordt een kleine, ontwikkelingsgesynchroniseerde cultuur van 50 tot 150 nematoden gevestigd. Om de nematoden tot de vroege volwassenheid te laten groeien, worden de Petri-schalen vier tot vijf dagen geïncubeerd bij 20 °C.

Spoel op de dag van de videoanalyse een plaat met jonge volwassen nematoden met één milliliter gedeïoniseerd gedestilleerd water om zo 50 tot 150 wormen uit de gesynchroniseerde cultuur te verzamelen. Gebruik een microcentrifuge om de wormen naar de bodem van de buis te centrifugeren of laat ze gedurende ongeveer 15 minuten bezinken door de zwaartekracht. Verwijder het grootste deel van het water uit de buis en vervang dit door één milliliter gedeïoniseerd gedestilleerd water om eventuele aanhechtende bacteriën van de nematoden te wassen.

Breng met een micropipet vijf tot 10 nematoden in water over naar een kwartsvacuümbuis. Stel de optische opstelling samen zoals hier getoond, met gebruik van een 543 nanometer heliumneonlaser voor oversampling, twee front-surface aluminium spiegels om de laserstraal door de vacuümbuis te sturen, een houder voor de vacuümbuis, een projectiescherm en een hogesnelheidscamera die in staat is om op ongeveer 240 frames per seconde te filmen. Gebruik vervolgens een stukje parafilm om de bovenkant van de vacuümbuis af te dekken en keer deze om om de nematoden in de waterkolom te mengen.

Plaats de vete in een vetehouder zodat de wormen zich aanvankelijk bovenaan de vete bevinden. Stuur de laserstraal met behulp van de spiegels door het centrum van de vete. Omdat de nematoden een hogere dichtheid hebben dan water, zullen ze langzaam naar de bodem van de vete zakken terwijl ze binnen de waterkolom zwemmen; kleur op het projectiescherm de plek die overeenkomt met de doorgelaten laserstraal zwart om verstrooiing te verminderen wanneer de doorgelaten straal het projectiescherm raakt.

Het elimineren of verminderen van verstrooiing van de doorgelaten bundel voorkomt dat de CCD-array van de camera verzadigd raakt door deze bundel. Om een maat voor de grootte van het diffractiepatroon vast te leggen, trekt u een lijn van ongeveer vijf centimeter op het projectiescherm naast de plek van de doorgelaten laserbundel, zonder het beeld van het gediffracteerde licht te storen. Schakel het kamerlicht uit en leg de diffractiebeelden op het scherm vast terwijl de wormen door de laserbundel bewegen.

Installeer voor de voorbereiding van de videogegevens het volgende programma voor videoanalyse en importeer de video in het programma. Gebruik de software om de oorsprong te laten samenvallen met de doorgelaten laserspot. Volg de hoekverdringing van het diffractiebeeld dat door elke nematode wordt gevormd.

Kopieer en plak de gegevens in een spreadsheet en voeg 180 graden of PI toe aan alle negatieve hoeken om een continue grafiek te genereren. Plaats, met behulp van de videoanalyse-opstelling, een fotodiode met een klein oppervlak uit het midden in het diffractiepatroon, direct voor het projectiescherm via een USB-poort.

Sluit de fotodiode aan op de digitale oscilloscoop die is verbonden met de computer. Observeer de klappaten op het computerscherm. Sla de datasets op in ASCII- of tekstformaat om de gegevens te analyseren.

Gebruik de video of de foto om de gegevens te importeren in een data-analyseprogramma dat in staat is om golfvormen te fitten. Pas chi-kwadraatminimalisatie toe om een sinusvormige curve te fitten en zo de klapfrequentie te bepalen. Bereken het gemiddelde van de zwemfrequenties van verschillende monsters en bepaal de variantie.

Voor deze studie werden de gegevens statistisch geanalyseerd met behulp van een één-factor ANOVA, gevolgd door de Bonferroni-toets voor meervoudige vergelijkingen. Een P-waarde van minder dan 0,05 wordt beschouwd als statistisch significant voor diffractiepatronen. Begin met het gebruik van een microscoop om afbeeldingen te maken om een afbeelding te optimaliseren.

Sleep het naar Mathematica. Gebruik het commando binary eyes om het om te zetten naar zwart-wit. Gebruik alternatief het commando edge detect om een zwart-witafbeelding te maken, waarbij de twee laatste getallen de grofheid van de resulterende randen bepalen.

Converteer vervolgens het beeld met het commando image data naar een matrix van nullen en enen. Gebruik het commando forer om de matrix te transformeren, kwadrateer daarna de absolute waarde van de matrix en bekijk het resulterende beeld, wat het diffractiepatroon is dat correspondeert met het oorspronkelijke beeld. Gebruik daarnaast de log-functie om het contrast van het beeld te schalen.

Vergelijk tenslotte de model-diffractiepatronen met de diffractiepatronen verkregen van vrij zwemmende wormen. In dit voorbeeld werden sea elegance bestudeerd in een kwarts Q-vet van één centimeter breed, vijf millimeter dik en vier centimeter hoog. Bemonstering van een enkele worm met behulp van video-analyse.

De gemiddelde zwemfrequentie verkregen uit videoanalyse in een vijf millimeter dikke vetlaag was ongeveer 2,5 hertz. Evenzo resulteerde het bemonsteren van een enkele worm met de methode voor realtime gegevensverwerving en een digitale oscilloscoop in een zwemfrequentie van ongeveer 2,7 hertz. Deze procedure kan voor veel wormen worden herhaald.

Een gedetailleerde studie van vrij zwemmende wormen onthulde een gemiddelde zwemfrequentie van 2,37 hertz in een vete van vijf millimeter. Zoals verwacht is de zwemfrequentie hoger dan die van een kruipende worm. Met deze diffractiemethode is vastgesteld dat de gemiddelde zwemfrequenties van een sea elegance, die beperkt is tot een microscoopglaasje, overeenkomen met de eerder gepubliceerde waarde van twee hertz.

Naar aanleiding van de video. De datapreparatie en modellering van diffractiepatronen die in deze video worden gedemonstreerd, maken het mogelijk om zwemdiffractiepatronen te modelleren. Met behulp van wormbeelden verkregen met een conventionele microscoop worden de gemodelleerde diffractiepatronen gebruikt om een zwemcyclus van de sea elegance te simuleren.

Een succesvol model bestaat uit fysiek haalbare succesvolle zwempatronen die overeenkomen met de zwemfrequenties. De worm moet aan het einde van de zwemcyclus in dezelfde vorm verkeren als aan het begin van een zwemcyclus. Zodra deze techniek onder knie is, kan deze in minder dan een minuut per worm worden uitgevoerd met behulp van het snelle fotodieet, terwijl de zwemcycli op het computerscherm worden geobserveerd.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u vrijzwemmende nematoden evalueert.