Bouw van een hoge resolutie microscoop met conventionele en holografische optische Trapping Capabilities
22 april 2013
Het hierin beschreven systeem maakt een traditionele optische val en onafhankelijk holografische optische trapping lijn, staat het creëren en manipuleren van meerdere vallen. Dit zorgt voor de creatie van complexe geometrische arrangementen van refractieve deeltjes terwijl ook toelaat gelijktijdig met hoge snelheid, hoge-resolutie metingen van de activiteit van biologische enzymen.
In deze procedure worden een conventionele en holografische optische opvanglijn geassembleerd en uitgelijnd Om dit te bereiken, meet u eerst de locaties voor optische componenten en monteert u vervolgens de componenten veilig op hun juiste plaatsen. Vervolgens lijnt u de optica uit om opvang mogelijk te maken. De laatste stap is het blokkeren van de TED-straal van de holografische spiegel.
Uiteindelijk staat het voltooide systeem gelijktijdige holografische en gewone opvang toe. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals alleen gewone opvang, is dat het gelijktijdige positionering van meerdere brekende objecten in drie dimensies en snelle objectmanipulatiemetingen mogelijk maakt. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat ontwerp, lay-out en uitlijning uitdagend kunnen zijn.
Het beginpunt van deze video is een optische tafel met het microscoop op zijn plaats om een optisch vangnet te creëren op 980 nanometer. Begin met een van de gemakkelijk verkrijgbare laserdioden van die golflengte. Gebruik een pig tail-laser met een polarisatie, behoudende enkele modusvezel van bekende modusvelddiameter.
De vezel moet lang genoeg zijn om als modusfilter te fungeren en moet worden afgesloten met een vezelkanaalconnector met een FCPC- of F-C-A-P-C-connector. De enkele modus optische vezel moet voorzichtig worden behandeld, bochten moeten worden vermeden. Bevestig de laserdiode en monteer die zodat er controle over vermogen en temperatuur mogelijk is.
De montage moet direct aan de optische tafel worden bevestigd om maximale passieve warmteafvoer te maximaliseren. Monteer vervolgens de vezelconnector op de bundeloptische optica. Zorg ervoor dat de gekozen vezelpoort overeenkomt met de modusvelddiameter van de diode.
Pigtailvezel bevestig de bundelaanpassing aan de optische tafel op voldoende afstand van het microscoop om ruimte voor bundelrouteringsuitbreiding en plaatsing van andere componenten te bieden. Staafkleuren kunnen worden gebruikt om de lensafstand voor robuuste herhaalbare positionering te fixeren. Pas de vezelpoort aan om consistente bundelverliezen over afstanden te garanderen die vergelijkbaar zijn met de totale bundelweg naar het microscoop.
Er zijn vijf spiegels in de baan van de DDE-laserstraal. Beginnend bij de laser dde, zijn er twee spiegels om de uitvoer in de microscoophusing te richten. De bundel moet ook door een dichroitische spiegel passeren, die onverminderde transmissie van de laserdiodebundel toelaat op 45 graden ten opzichte van de hoek van incidentie.
Ten slotte twee extra korte doorlaatdiic-spiegels die zichtbaar licht doorlaten, maar dichtbij infrarood en hoger reflecteren. Route de bundel in en uit het microscoop. Oneindigheidsruimte één is binnen de microscoophusing om de spiegels aan te passen, verwijder het microscoopobjectief.
Gebruik de spiegels en een infrarood kijkkaart om de bundel door de opening in de objectiefmontagefase te leiden. Als de bundel niet gecentreerd is, pas de spiegels aan om de uitlijning te repareren zodat de bundel op centrum staat. Bij het monteren van lenzen kan een kooisysteem resulteren in een stijve montage.
Schroefmaten kunnen worden gebruikt om afstanden tussen lenzen langs kooistavende voor installatie te vooraf meten. Monteer tijdelijk een rode laserpointer met een aangepaste adapter in plaats van het objectief zodat de bundel langs de optische as van het microscoop ligt. Gebruik de zichtbare laserpointerbundel om de 980 nanometer bundeluitbreider ruwweg te plaatsen en uit te lijnen.
Deze setup gebruikt lenzen met een brandpuntsafstand van 60 millimeter en 125 millimeter in een keary-opstelling om de bundelhals ongeveer te verdubbelen. Installeer vervolgens de 980 nanometer stuurlenzen met behulp van de aanwijzerbundel als gids hier. Elke lens heeft een 60 millimeter brandpuntsafstand montage, de eerste lens in de bundelbaan op een nauwkeurige X, Y, Z-fase met minimaal een halve inch bereik van reis om bundelbesturing mogelijk te maken.
De tweede lens kan nu worden gepositioneerd om een een-op-een keary-opstelling met de eerste lens te vormen. Deze lens moet worden gepositioneerd om optisch geconjugeerd te zijn aan het achterste brandpuntvlak van het objectief. Om de holografische vangst te bereiden, monteer de 1064 nanometer laser op een verhoogd platform op ongeveer de hoogte van de 980 nanometer bundel.
Plaats een halfgolfplaat en polarisator direct na de laseruitvoer. Om handmatige aanpassing van laservermogen mogelijk te maken. Installeer de bundeluitbreider voor deze laser zodat de bundelverliezen worden uitgebreid om overeen te komen met de diagonale grootte van de holografische spiegel.
Als beperkt door ruimte, gebruik hier lenzen met kleine brandpuntsafstanden, 16 millimeter en 175 millimeter. Gebruik nu de laserpointerbundel om de ruimtelijke lichtmodulator of SLM te positioneren, die deel uitmaakt van de commerciële holografische pakket die wordt gebruikt. In dit experiment moet de ruimtelijke lichtmodulator zo worden gepositioneerd dat deze optisch geconjugeerd is aan het achterste brandpuntvlak van het objectief.
Plaats het zodat de laserpointerbundel de minimaal mogelijke hoek van incidentie heeft, maar zodat de reflectie veilig alle hardware op de optische tafel verlaat. Plaats nog een spiegel voor de 1064 nanometer bundeluitbreider om het licht naar de ruimtelijke lichtmodulator te leiden. Zorg ervoor dat het laserpointerlicht het centrum van de bundeluitbreideropening raakt.
Installeer ten slotte een telescooppaar lenzen tussen de ruimtelijke lichtmodulator en de dichroitische spiegel. Deze lenzen hebben brandpuntsafstanden van 125 millimeter en 200 millimeter. Verwijder de laserpointer, laat de aangepaste adaptermontage achter om als grove uitlijningsapertuur te dienen.
Begin met het controleren van de uitlijning met alleen de 980 nanometer bundel. Gebruik een infrarood kaartviewer om de 980 nanometer bundel uit te lijnen om langs de centrumas van de opening in de aangepaste adapter te gaan. Gebruik vervolgens de infrarood kaart om ervoor te zorgen dat de 1064 nanometer bundel dezelfde plekken raakt als de 980 nanometer bundel langs hun gedeelde bundelbaan.
Zodra dit is voltooid, vervangt u de aangepaste laserpointermontageadapter door een olie- of waterobjectief met een hoge numerieke apertuur. Lijn vervolgens de 980 nanometer vangst uit door de laserbundel te laten lopen totdat een
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een systeem dat conventionele en holografische optische pincettechnieken integreert, waardoor de manipulatie van meerdere traps mogelijk wordt. Deze innovatieve aanpak vergemakkelijkt de creatie van complexe geometrische arrangementen van refractieve deeltjes, terwijl het tegelijkertijd snelle metingen met een hoge resolutie van biologische enzymactiviteit mogelijk maakt.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Optische pincet
- Biofysica
- Meting van enzymactiviteit
Achtergrond
- Traditionele optische trapping-methoden zijn beperkt in hun vermogen om meerdere objecten gelijktijdig te manipuleren.
- Holografische optische trapping biedt verbeterde flexibiliteit bij het positioneren en manipuleren van deeltjes.
- Het combineren van deze technieken kan de meetnauwkeurigheid en -snelheid verbeteren.
- Nieuwe gebruikers kunnen tegen uitdagingen aanlopen bij het ontwerp en de uitlijning van optische componenten.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een systeem dat gelijktijdige conventionele en holografische optische pincetten mogelijk maakt.
- Het mogelijk maken van de manipulatie van meerdere refractieve objecten in drie dimensies.
- Het faciliteren van snelle metingen van biologische enzymactiviteit.
Gebruikte methoden
- Assemblage en uitlijning van de componenten voor optische trapping.
- Meting van de posities voor de optische componenten.
- Veilige montage van de componenten op de aangewezen posities.
- Uitlijning van de optiek om effectieve trapping mogelijk te maken.
Belangrijkste Resultaten
- Het systeem integreert succesvol conventionele en holografische trapping-technieken.
- Het maakt de gelijktijdige positionering van meerdere refractieve objecten mogelijk.
- Er werden hogesnelheidsmetingen van enzymactiviteit gerealiseerd.
- Gebruikers rapporteerden uitdagingen bij de initiële configuratie, maar erkenden de voordelen van het systeem.
Conclusies
- Het ontwikkelde systeem verbetert de mogelijkheden van optische trapping-technieken.
- Het biedt aanzienlijke voordelen voor onderzoekers die biologische processen bestuderen.
- Verdere training kan noodzakelijk zijn voor nieuwe gebruikers om de opstelling te beheersen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Optische trapping-systemen maken een precieze manipulatie van refractieve objecten mogelijk voor kracht- en bewegingsmetingen met een hoge resolutie op nanometer- en piconewton-schaal. De integratie van conventionele en holografische trapping maakt gelijktijdige positionering van meerdere objecten en 3D-controle in realtime mogelijk, wat mechanistische studies naar moleculaire interacties en cellulaire mechanica ondersteunt. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door een kwantitatieve beoordeling van bindingskrachten en conformationele veranderingen onder fysiologische omstandigheden mogelijk te maken.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door directe meting van moleculaire bindingskrachten en de dynamiek van complexvorming.
- Operationele waarde: Biedt functionele targetvalidatie door in real-time krachten op piconewton-schaal te meten die worden gegenereerd door moleculaire motoren of enzymactiviteit.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door het genereren van kwantitatieve kracht-verplaatsingsgegevens die correleren met target-engagement en het werkingsmechanisme.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door gecontroleerde manipulatie van diëlektrische kraaltjes of cellulaire organellen als krachtsensoren mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays door nauwkeurige positionering en gelijktijdige uitlezing van de valpositie ten opzichte van de beweging van het object.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt screening-gereedheid via holografische patroongeneratie voor parallelle trapping van meerdere objecten in het gezichtsveld.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Behoudt de relevantie voor ziektebeelden door de meting van mechanische eigenschappen op nanoschaal mogelijk te maken in primaire cellen of weefselafgeleide modellen onder bijna-fysiologische omstandigheden.
- Mechanistische risicoreductie: Verbindt observaties uit de ontdekkingsfase met preklinische validatie via read-outs van krachtproductie die strategieën voor doelwitmodulatie informeren.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door te kwantificeren hoe perturbaties de mechanische output beïnvloeden in ziekterelevante systemen.
Pipeline- & workflowintegratie
Het systeem past binnen het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing via lead-identificatie tot preklinische validatie, door kwantitatieve biofysische read-outs te leveren die bijdragen aan de prioritering van targets en de elucidatie van mechanismen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door directe meting van intermoleculaire krachten en conformationele veranderingen in proteïnecomplexen mogelijk te maken.
- Screening: Biedt assay-gereedheid door middel van snelle, hoge-resolutie positiebepaling van gevangen objecten, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen via krachtgebaseerde readouts faciliteert.
- Analytics: Genereert verplaatsingsmetingen op nanometerschaal en krachtmetingen in piconewtons, waardoor teams condities kunnen vergelijken en de effectiviteit van targetmodulatie kunnen beoordelen.
- Translationeel onderzoek: Legt de verbinding met preklinische continuïteit door mechanische fenotypering in ziekterelevante cellulaire systemen mogelijk te maken, wat de afstemming van biomarkers voor mechanotransductie-pathways ondersteunt.
- Enterprise-hergebruik: Fungeert als een herbruikbaar platform voor multiparametrische analyse over verschillende projecten heen, waardoor redundante opstarttijden worden verminderd en standaardisatie van krachtmetingsprotocollen tussen teams mogelijk wordt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellend vertrouwen door directe, labelvrije meting van mechanische output, waardoor ambiguïteit bij de interpretatie van het doelmechanisme wordt verminderd.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en schaalbaarheid via holografische trapping-patronen en gelijktijdige controle over meerdere objecten, wat de doorvoer bij krachtmetingscampagnes verbetert.
- Strategische waarde: Verhoogt de kapitaalefficiëntie door vroegtijdige risicoreductie van targets mogelijk te maken via kwantitatieve krachtgegevens, waardoor laatstadium-falen door onvoorziene mechanische beperkingen wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Informeert risico-gecorrigeerde prioritering door objectieve, kwantitatieve gegevens te leveren over de sterkte van target-binding en conformationele dynamiek over verschillende kandidaatmoleculen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in optische uitlijning, laserveiligheid en optimalisatie van het straalpad voor systemen met trapping op twee golflengten.
- Is afhankelijk van een stabiele infrastructuur van de optische tafel, precisie-verplaatstrappen en infrarood-compatibele componenten voor de integratie van 980 nm en 1064 nm lasers.
- Vereist cross-team standaardisatie van trapping-protocollen, kalibratieprocedures en data-analysepipelines voor kracht- en verplaatsingsmetingen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij de overgang van assays op basis van beads naar primaire cellen of weefselexplanten, vanwege variërende brekingsindices en beperkingen met betrekking tot de levensvatbaarheid van monsters.
- Wordt beperkt door de complexiteit van de uitlijning en potentiële aberraties door niet-overeenkomende straalprofielen, met name wanneer holografische patronen interageren met de geometrie van de spatial light modulator.
