Eencellige micro-injectie voor mobiele Communicatie Analyse

Hallo, mijn naam is Anael. Ik werk bij de Oswaldo Cruz Foundation in het Cellular Communication Laboratory. Hier bestuderen we P2 Receptoren en gap injectie in de context van het immuunsysteem en de lever.

Vandaag zal ik de micro-injectie van cellen aan je presenteren. Gap injecties spelen een fysiologische rol bij synapsoverdracht, hartcontracties en andere processen. Voor deze techniek kunnen we bestuderen of de gap injecties functioneel zijn of niet.

Oké, laten we de basiscomponenten van de micro-injectie opstelling bekijken. Hier hebben we de omgekeerde fluorescentiemicroscoop waar we de cellen zullen zien. Dit is een CCD-camera om de resultaten vast te leggen.

We hebben hier de stroomgenerator waarmee we de kleurstof in de cel zullen introduceren. Verder hebben we de houder waar de micro-elektrode is aangesloten. En de micro-manipulator die verbonden is met de houder en de beweging van de micro-elektrode in de drie assen, Z, Y en X mogelijk maakt. Voordat we met het experiment beginnen, moeten we de micro-elektrode maken.

We gebruiken deze boorsilicaat-glazen capillair en dit apparatuur genaamd polar. We bevestigen de boorsilicaat capillair hier. Deze wolfraamdraad zullen we verwarmen om twee micro-elektrodes te maken.

Nu verwarmt de wolfraamdraad en de golf hier zullen we naar beneden trekken om de twee micro-elektrodes te maken. Gemakkelijk. Onze eerste stap is om de micro-elektrode te vullen met de kleurstof. Een tip hier is dat je alleen de punt moet vullen met een paar microliters om het experiment te doen.

Het is niet nodig om alles te vullen. Let op met meer details. Vul alleen de punt.

Laten we een experiment beginnen. We hebben hier de cellen in het petrischaaltje, in een natriumoplossing. De zilverdraad is verbonden met de stroomgenerator.

We moeten nu de micro-elektrodes in de hoofdfase bevestigen. Hier in de hoofdfase hebben we ook een zilverdraad verbonden met de stroomgenerator. Zodra de micro-elektrode is bevestigd, kunnen we het in het bad plaatsen.

Let op dat de punt van de pipet voorzichtig het bad raakt. Deze procedure wordt heel voorzichtig uitgevoerd om te voorkomen dat de punt in de bodem van het petrischaaltje crasht. Eenmaal in het bad kunnen we naar de microscoop gaan om naar de schaduw van de micropipet te zoeken.

We raden aan dat we beginnen met kijken in de vergrotingslens. Als we de schaduw van de pipet vinden, kunnen we de micro-elektrode naar de cel bewegen met behulp van de micro-manipulator. Zodra het erg dicht bij de cel is, kunnen we een testpost doen om te controleren of de micro-elektrode niet geblokkeerd is.

Hoe we zullen zien volgende. Hier zien we de micropipet en we passen de micropipet heel dicht bij de cel aan. We kunnen celbeweging rechts en links zien.

Dan veranderen we naar het filter, het fluorescentiefilter. We kunnen een hyperpolariserende puls toepassen om te testen of de punt van de pipet niet geblokkeerd is. Omdat de micropipet in de cel is, kunnen we een hyperpolariserende puls toepassen om de cel met de kleurstof te laden.

We gebruiken hier de losse gele kleurstof. Nadat we de cel met de kleurstof hebben geladen, als de buurcellen zijn verbonden door gap injecties, wachten we enkele minuten en zullen we buurcellen zien oplichten door de diffusie van de kleurstof door deze gap injecties. In ons experiment kunnen we vijf cellen zien, gemarkeerd met sterren, die fluorescentie vertonen.

Hier is een goed voorbeeld van een experiment van micro-injectie in thymische epitheelcellen, in A en B. In de figuren C en D, toont een micro-injectie in een thymische inert cell met losse gele kleurstof en een andere kleurstof, niet permeabel voor gap injectie, getoond in de inzet. De figuur E en F toont een thymische epitheelcel met losse gele kleurstof geïnjecteerd en in de inzet losse gele kleurstof en een gap injectieblok. De resultaten laten zien dat de losse gele kleurstof zich niet heeft verspreid naar de buurcellen.

Vervolgens zien we een micro-injectie in thymische epitheelcellen, in aanwezigheid van dexamethason en de kwantificering in B. Dexamethason verhoogde de mate van koppeling, zoals getoond in de figuur B. Van 100 injecties was het aantal cellen dat drie of vier cellen verbond vaker in aanwezigheid van dit medicijn. Ik hoop dat ik beginners kan helpen om deze belangrijke techniek voor studie van cellulaire communicatie te doen. Bedankt en doei.