Bacteriële kunstmatige chromosomen: Een Functional Genomics Tool voor de Studie van Positive-streng RNA-virussen

Het algemene doel van deze procedure is het redden van infectieuze virusdeeltjes die volledig zijn gemaakt van een gekloond cDNA van RNA-virussen met een positieve streng, waarvan de genomen dezelfde polariteit hebben als cellulair mRNA, zoals het Japanse encefalitisvirus. Deze op cDNA gebaseerde reverse genetica is een fundamentele methode die directe manipulatie van het virale genomische RNA mogelijk maakt, waardoor recombinante virussen kunnen worden gegenereerd voor moleculaire en genetische studie naar virale replicatie en pathogenese. Deze techniek biedt tevens een waardevol platform dat de ontwikkeling mogelijk maakt van genetisch gedefinieerde vaccinia-virale vectoren voor de aflevering van vreemde genen.

Deze methoden zijn toepasbaar voor het klonen van cDNA over de volledige lengte voor negatieve of positieve stammen, RNA-virussen, in het bijzonder virussen met genomen groter dan 10 kb. De procedure zal worden gedemonstreerd door verschillende leden van mijn laboratorium: research assistent Sang-Im Yun, postdoctoral fellows Byung-Hak Song en Jin-Kyoung Kim en de bachelorstudent Jordan Frank.

Het videogedeelte van deze publicatie behandelt de preparatie van het bacteriële kunstmatig chromosoom dat de sequenties van belang bevat, de synthese van RNA, getranscribeerd vanuit het back-plasmide, en hoe de infectiviteit van de RNA's en de virusopbrengst kunnen worden gemeten. Alle procedures die voorafgaan aan het genereren van het BAC-plasmide worden in detail beschreven in het tekstprotocol. Groei voor deze procedure eerst een enkele kolonie E. coli DH10B, die het BAC-plasmide draagt, in drie milliliter 2X YT-bouillon met chloramfenicol. Incubeer de cultuur gedurende 10 uur bij 35 °C met schudden op 225 tot 250 RPM.

Schaal de kweek na 10 uur op. Inoculeer vervolgens 500 µL van de groeicultuur in 500 ml medium en kweek het inoculum zes uur lang onder krachtig schudden. Centrifugeer na zes uur de bacteriële kweek in twee flessen van 250 ml bij 3.100 g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Resuspendeer vervolgens elke pellet in 30 ml GTE-oplossing.

Voeg 500 microliters lysozym toe en incubeer de suspensies 10 minuten op ijs. Bereid ondertussen verse lysisoplossing voor de volgende stap. Voeg na 10 minuten 60 milliliters van de lysisoplossing toe en meng door te wervelen tot de oplossing helder is.

Laat de reacties 10 minuten lang op kamertemperatuur verlopen. Voeg vervolgens 45 milliliter neutralisatieweloplossing toe aan elk flesje en keer de flesjes om tot ze grondig zijn gemengd. Plaats ze daarna 10 minuten op ijs.

Verzamel de geneutraliseerde lysaten met behulp van gekoelde centrifugatie bij een hoog g-getal. Verzamel vervolgens de supernatanten in twee nieuwe flessen van 250 milliliter. Voeg aan elk volume 0,6 volumes 100% isopropanol toe en plaats deze gedurende 20 minuten op ijs.

Centrifuge vervolgens de precipitaten, verwijder dan de supernatanten en los de pellets op in vijf milliliter TE-buffer. Voeg de twee volumes samen in één buis van 50 milliliter en precipiteer het RNA door een gelijk volume vijf molair lithiumchloride toe te voegen en het mengsel 10 minuten op ijs te incuberen. Gebruik een koude centrifugatie van 20 minuten om het RNA-precipitaat te verzamelen.

Overbreng vervolgens de supernatant naar een nieuwe buis van 250 milliliter, voeg twee volumes 100% isopropanol toe en plaats de buis op ijs zodat het DNA-precipitaat zich kan vormen. Centrifugeer het precipitaat na 20 minuten, aspireer de supernatant, resuspendeer de DNA-pellet in 9,5 milliliter TE-buffer en overbreng de DNA-oplossing naar een buis van 50 milliliter.

Zet de preparatie voort door een cesiumchloride-gradiënt met ethidiumbromide op te stellen. Breng het mengsel met een spuit met een 18 gauge naald over in een afsluitbare polypropyleenbuis en sluit de buis af. Centrifugeer de afgesloten buis gedurende de nacht in een ultracentrifuge om een cesiumchloride-gradiënt te vormen.

Verzamel de volgende dag een DNA-band van het BAC-plasmide uit de cesiumchloridegradiënt. Gebruik een naald van 18 gauge om een ontluchtingsgat aan de bovenkant van de gradiënt te maken en een naald van 20 gauge met een spuit om het BAC-DNA aan de zijkant van de gradiënt te verzamelen; breng de verzamelde fractie vervolgens over naar een microcentrifugebuis van 1,7 milliliter. Voer een wasstap uit door 2,5 volumes verzadigde butanol in water toe te voegen en meng dit door middel van normaal vortexen.

Centrifugeer het mengsel vervolgens bij kamertemperatuur en breng de onderste waterige fase over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,7 milliliter. Herhaal deze wasstap in totaal zes keer om al het ethidiumbromide te verwijderen. Precipiteer nu het BAC-DNA. Voeg een volume van een tiende drie molaire natriumacetaat en 2,5 volumes 100% ethanol toe aan de buis. Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens het precipitaat bij kamertemperatuur en was het DNA-pellet met één milliliter 70% ethanol. Herhaal het centrifugeren en verzamel het pellet opnieuw. Droog het gepelletteerde DNA ten slotte 10 minuten aan de lucht en elueer het in 200 microliters TE-buffer.

Begin met een grootschalige restrictie-enzymvertering van het BAC-plasmide met Xba-one in een totaal volume van 100 µL. Voer deze vertering uit bij 37 °C gedurende 12 tot 15 uur. Incubeer de vertering vervolgens verder met nog eens 25 units mungboon-nuclease bij 30 °C gedurende twee uur.

Vul na de incubatie het volume aan tot 300 µL met gedestilleerd water. Voer vervolgens een fenolextractie uit door een gelijk volume fenol-chloroform-isoamylalcohol aan het verdunde monster toe te voegen, het mengsel een minuut krachtig te vortexen, de buis te centrifugeren en de bovenste waterige fase over te brengen naar een nieuwe buis.

Herhaal vervolgens de extractie met chloroform. Win daarna het gelineariseerde BAC-DNA terug door middel van ethanolprecipitatie. Verzamel de DNA-pellet via centrifugatie, verwijder het supernatant en was de pellet met één milliliter 70% ethanol. Herhaal de centrifugatiestap en laat de pellet aan de lucht drogen. Los de DNA-pellet na 10 minuten drogen op in 30 µL gedestilleerd water. Analyseer vervolgens één µL van het teruggewonnen BAC op een 0,8% agarosegel.

Stel vervolgens een runoff-transcriptie van 25 µL op van het gelineariseerde BAC-DNA, inclusief getritieerd UTP voor RNA-kwantificering. Voer de reactie uit bij 37 °C gedurende een uur. Analyseer daarna één of twee µL van de runoff-transcriptiereactie op een 0,6% agarosegel.

Begin met BHK-21-cellen die gedurende 24 uur zijn gekweekt in schalen van 150 millimeter met een platingdichtheid van 3 miljoen cellen per schaal. Spoel de cellaag met koude oplossing A en detach de cellen vervolgens door trypsinisatie. Verzamel de cellen door centrifugatie bij 270 g gedurende twee minuten.

Resuspendeer de cellen vervolgens in 50 milliliters koude oplossing A en centrifugeer ze opnieuw. Herhaal deze wasstap drie keer. Resuspendeer de cellen na de laatste wasbeurt in oplossing A met een concentratie van 20 miljoen per milliliter. Meng daarna een aliquot van 400 microliter van de cel-suspensie met twee micrograms synthetisch RNA in een cuvet van twee millimeter.

Elektroporeer het mengsel direct onder optimale omstandigheden en laat de cellen 10 minuten rusten. Breng de cellen vervolgens over naar een microcentrifugeebuisje met 600 µL compleet kweekmedium. Bereid nu een tienvoudige seriële verdunning van de geëlectroporeerde cellen in volumes van 1 mL. Plaat 100 µL aliquots van elke verdunning op monolagen van normale BHK21-cellen. Na vier tot zes uur incubatie worden de cellen bedekt met 0,5% agarose in MEM plus FBS en gedurende nog vier dagen gekweekt.

BHK21-cellen werden mock-electroporeerd of electroporeerd met RNA-transcripten afgeleid van twee onafhankelijke klonen van de volledige JEV-BAC. Vier dagen later werden de cellen gekleurd met kristalviolet om het infectieuze RNA in de cellen te visualiseren. Met behulp van deze kleuring werden de infectieuze centra gekwantificeerd. Vervolgens werd de expressie van virale eiwitten in de met RNA electroporeerde cellen 20 uur na transfectie onderzocht met behulp van anti-NS-one konijnen antiserum en een Cy3-geconjugeerd secundair antilichaam, zichtbaar in rood. De kernen werden tegengekleurd met DAPI, zichtbaar in blauw. Later, op 22 en 40 uur na transfectie, werd de productie van infectieuze virionen die zich ophoopten in de cultuursupernatanten van de met RNA electroporeerde cellen onderzocht via plaque-assays.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u infectieus virus volledig kunt redden uit een gekloonde cDNA van een positieve stam, RNA, zoals het Japanse encefalitisvirus. Vergeet niet dat het werken met het Japanse encefalitisvirus en andere humane pathogenen uiterst gevaarlijk kan zijn. Een juiste biosafety-training is noodzakelijk voordat u deze procedure uitvoert.