Snelle en efficiënte generatie van de neuronen van menselijke pluripotente stamcellen in een Multititre Plate Format

Het algemene doel van het volgende experiment is om menselijke pluripotente stamcellen of H PSCs te differentiëren tot neuronen met behulp van een multi-titerplaatformaat. Dit wordt bereikt door een enkelcellesuspensie van H PSCs te oogsten en uit te platen in V-bodem 96-wells platen om gedurende de nacht embryoid bodies of EB's te vormen.

Vervolgens worden de EBS overgebracht naar U-bodem platen met ultra-lage hechting die differentiatiemedium bevatten om de vorming van neuroectoderm te induceren. Daarna worden de EBS uitgeplaat op met Matrigel gecoate schalen om de uitgroei van neuronen te bevorderen. Rond dag acht kunnen resultaten worden verkregen die via immunofluorescentie de aanwezigheid van typische neuronale markers aantonen.

Kleuringsprotocollen voor het differentiëren van menselijke pluripotente stamcellen tot neuronen zijn vaak ingewikkeld en tijdrovend. Bijna bij toeval zijn we op een zeer eenvoudige procedure gestuit om neuronen te maken uit menselijke pluripotente stamcellen.

Vanuit een technisch oogpunt is het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden dat deze eenvoudig uit te voeren, snel en kostenefficiënt is. Tegelijkertijd zal Dr MI Z uit het laboratorium de procedure presenteren. Bereid het EB-vormingsmedium en het differentiatiemedium voor zoals beschreven in het schriftelijke protocol.

Kweek h PSCs onder feeder-vrije omstandigheden, zoals een met meth geconditioneerd medium op met matrigel gecoate platen, of met behulp van chemisch gedefinieerde culturesystemen onder subconfluente, actief groeiende omstandigheden. Gebruik een stereomicroscoop met een steriele plastic pipetpunt om spontaan gedifferentieerde kolonies mechanisch te verwijderen. Was de overgebleven ongedifferentieerde kolonies met PBS en gebruik Accutane met one x rock inhibitor voor digestie tot enkelvoudige cellen.

Pellet de enkelvoudige cellen door centrifugatie bij 200 G gedurende twee minuten en resuspendeer deze in een klein volume EB-vormingsmedium. Gebruik een hemocytometer om de celconcentratie te bepalen. Voeg extra cellen toe aan het resterende EB-vormingsmedium om een concentratie tussen 40 000 en 80 000 cellen per milliliter te bereiken.

Breng met een meerkanaalpipet 100 µL per put over naar een 96-well plaat met V-bodem, wat resulteert in 4.000 tot 8.000 cellen per put. Centrifugeer de plaat in een swing-out plaatcentrifuge bij 400 ×g gedurende één minuut om alle cellen op de bodem van de putten te verzamelen. Plaats de cellen in een incubator en laat de EBS gedurende de nacht vormen; observeer deze de volgende dag onder de stereomicroscoop.

Verzamel de EBS en breng deze in een klein volume over naar een bacteriële schaal van 3,5 centimeter die twee milliliter differentiatiemedium bevat. Was de cellen door de schaal voorzichtig te roteren. Voeg 100 microliter differentiatiemedium toe aan elke put van een ultra low attachment plate.

Onderzijde van een 96-wellplaat onder een stereomicroscoop. Breng EBS in kleine volumes over van de wasschaal naar de 96 U-wells. Incubeer de EBS gedurende vier dagen om de vorming van neuroectoderm op de vierde dag mogelijk te maken.

Was de cellen in differentiatiemedium en zaai ze één voor één uit in de putjes van een met matrigel gecoate multi-titerplaat, zoals een 12-wells plaat. De cellen moeten gelijkmatig over de putjes worden verdeeld om een ongestoorde uitgroei van neuronen mogelijk te maken. Laat de EBS ongeveer 10 minuten bij kamertemperatuur losjes hechten aan de matrigel.

Plaats de plaat vervolgens voorzichtig in de incubator. De neuronen zullen gedurende de volgende vier dagen radiaal uitgroeien vanuit de uitgeplaatte EBS. Voorheen hebben wij aangetoond dat, in overeenstemming met veel anderen, EBS uit H PSCs eenvoudig konden worden gegenereerd door het opnieuw uitplaten van aggregaten na het routinematig splitsen van H HPCs in laag-adhesieve schaaltjes.

Dit resulteert gewoonlijk in een brede distributie van celgroottes. Een ander probleem is dat EB's die in suspensie worden gehouden, de neiging hebben om met elkaar te aggregeren, wat leidt tot een nog grotere heterogeniteit in grootte. Om dit te omzeilen, werden enkele hPSCs geplaatst in wells met een lage hechting, wat resulteerde in geen EB-vorming en celdood. Echter, door het celoverlevingsmolecuul Y 2 7 6 3 2 te combineren met polyvinylalcohol, waarvan is aangetoond dat het de EB-vorming uit hESC's verbetert, konden EB's gedurende de nacht worden gevormd vanuit hESC-suspensies van enkele cellen.

Gemakkelijkerwijs konden de EB-groottes in dit multi-titerplaatformaat nauwgezet worden gecontroleerd door verschillende aantallen cellen per well te plaatsen. In tegenstelling tot het gebruik van conventionele technieken, werd na het overbrengen van EB's naar ultra-low attachment 96 U platen de vorming van neuroectoderm geïnduceerd met een cocktail van kleine moleculen bestaande uit F-G-F-E-R-K-T-G, TGF beta SMA twee, en BP SMA one remmers, waardoor de cellen vervolgens op matrigel konden worden geplaatst om neuronen te vormen. Het initiëren van EB-vorming vanuit ongeveer 8, 000 cellen leverde de beste neuronale differentiatiecapaciteit op, wat wordt gekenmerkt door uitgesproken neuronale uitlopers vanuit de geplaatste EB's.

Verminderde necrotische EB-centra na het uitplaten en een hoge expressie van sensorische en pan-neuronale markers zoals B rrn three A en beta three tubulin. De algehele neurale differentiatie-efficiënties lijken vergelijkbaar met de oorspronkelijke procedure, die tot nu toe toepasbaar is op zowel HSC's als HI PSC's. Drie onafhankelijke HPSC-lijnen, zowel HES- als HIPS-cellen, zijn succesvol getest in de multi-well procedure, hoewel cellijn-afhankelijke variabiliteit en differentiatie-efficiënties over het algemeen niet kunnen worden uitgesloten.

Deze figuur toont gedissocieerde enkelvoudige neuroectodermale cellen van dag vier die als enkelvoudige cellen zijn uitgeplaat en met een efficiëntie van ongeveer 60% succesvol zijn gedifferentieerd. Het hanteren van EBS in het multi-titter platform vereist in het begin wat training, maar na enige tijd zult u merken dat het vrij eenvoudig is.