Karakteriseren Multiscale mechanische eigenschappen van hersenweefsel met behulp van Atomic Force Microscopy, Impact Inspringen en reometrie
6 september 2016
We presenteren een reeks technieken om de visco-elastische mechanische eigenschappen van de hersenen te karakteriseren op micro-, meso- en macro-schalen.
Het algemene doel van deze mechanische karakteriseringstechnieken is om de visco-elastische eigenschappen van biologisch weefsel te meten op verschillende lengte-schalen en laadsnelheden. Deze methoden kunnen worden gebruikt om belangrijke vragen in de biologische techniek te beantwoorden. Bijvoorbeeld, hoe vervormt de hersenen onder zeer hoge laadsnelheden, of hoe beïnvloeden ziekten zoals multiple sclerose of autisme de mechanische eigenschappen van hersenweefsel.
Het belangrijkste voordeel van deze technieken is voor materialen met een zeer lage stijfheid en zeer hoge hydratatie, zoals biologisch weefsel, kunt u testen over een breed scala aan laadcondities, en u kunt ook testen over een breed scala aan materiaalvolumes, tot op het niveau van een enkele cel, en tot op het niveau van een hele hersenen. De implicaties van deze technieken strekken zich uit tot het modelleren van de respons van de hersenen tijdens verwondingen, wat belangrijk is voor het ontwikkelen van beschermende strategieën. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de mechanische eigenschappen van de hersenen, kan deze ook worden toegepast op andere compliante biologische weefsels, zoals hart en lever.
Tijdens de mechanische karakterisering van compliante weefsels is het vaststellen van een juiste contact tussen de meetpomp en het weefsel cruciaal. Laad zorgvuldig een AFM-pomp met een nominale veerconstante van 0,03 newton per meter en een borosilicaatkraal met een diameter van 20 micrometer in de pomphouder. Plaats een in een petrischaal gemonteerde hersensnede op een op een AFM-trap gemonteerde verwarming die is voorverwarmd tot 37 graden Celsius.
Voeg vervolgens ongeveer twee milliliter voorverwarmd medium toe. Voeg vervolgens voorzichtig een druppel medium toe aan de AFM-pomp om het te beschermen tegen breken door oppervlaktespanning wanneer het in het medium rond de hersensnede wordt neergelaten. Vervolgens positioneert u de AFM-kop opnieuw op de trap en begint u de kop te laten zakken totdat deze ondergedompeld is in het medium.
Gebruik de optische microscoop om de trap zo te verplaatsen dat het gebied van belang zich onder de gekalibreerde AFM-pomp bevindt, laat vervolgens de AFM-pomp zakken om contact te maken met het oppervlak van het weefsel. Om de kruipcompliance-experimenten uit te voeren, bouwt u een toegepaste krachtfunctie in de functie-editor van de software. De functie bestaat uit een 0,1 seconde ramp tot een ingestelde waarde van 5 nanonewton die 20 seconden wordt vastgehouden, gevolgd door een ramp van één seconde tot nul nanonewton.
De software registreert gegevens over de indrukking van de AFM-pomp in het weefsel tijdens de toegepaste krachtfunctie. Na het uitvoeren van het kruipcompliance-experiment, voert u krachtrelaxatie-experimenten uit door een toegepaste indrukkingsfunctie in de software te maken. Voer deze functie uit terwijl de software gegevens verzamelt over de kracht die de AFM-pomp ervaart terwijl deze in het weefsel wordt ingedrukt.
Om impactindrukkingstests te beginnen, past u een sferische pomp aan door deze met behulp van pincetten op het slinger te schuiven. Bevestig vervolgens de gefuseerde kwartsmonsterpost op de plaat en schroef de plaat in de translationele trap. Om dynamische impactexperimenten op gehydrateerde hersenweefsels mogelijk te maken, voert u eerst de liquid cell-kalibratie uit.
Ga naar het kalibratiemenu in de software, selecteer Liquid Cell en volg de softwareaanwijzingen om contact te maken met het gefuseerde kwartsmonster. Selecteer vervolgens Normaal voor de Indenter Type en gebruik de standaardwaarde van 0,05 millinewton voor de Indenter Load. Klik vervolgens op Doorgaan om de kalibratie voor de normale indenterconfiguratie uit te voeren.
Verplaats nu de monsterstap minimaal vijf millimeter terug en monteer de hefboom. Herhaal de liquid cell-kalibratie in de nieuwe configuratie door Liquid Cell te selecteren voor het indentertype. Klik op Doorgaan om de liquid cell-kalibratiefactor te verkrijgen.
Verhoog vervolgens de condensorplaatafstand. Het verhogen van de condensorplaatafstand zal de maximale meetbare diepte verhogen, wat noodzakelijk is bij het testen van zeer compliante materialen. Draai met een sleutel de drie moeren die de condensorplaatafstand regelen met kleine stapjes met de klok mee.
Na elke volledige draai met de klok mee, selecteert u Bridge Box Adjustment onder het onderhoudsmenu en verkrijgt u een goede slingertest. Ga door met het langzaam aanpassen van de moeren totdat de Approx. Depth Calibration een waarde van 70.000 nanometer per volt of hoger leest.
Positioneer vervolgens een nieuwe eindstop aan de onderkant van de slinger die kan worden in- en uitgeschakeld via een voeding. Trek de originele eindstop die achter de slinger zit, om een mogelijke obstructie van de slingerbeweging te verwijderen en hogere slagsnelheden en hogere penetratiedieptes in compliante monsters mogelijk te maken. Schakel de voeding voor de solenoïde in en stel deze in op 10 volt.
Ga vervolgens naar het Experimentmenu en selecteer Impact en Impulse Displacement aanpassen. Volg de software-instructies om de zwaaiafstand van de slinger te kalibreren. Wanneer de impactindrukkingsopstelling volledig is voltooid, aspireer het medium en droog de hersensnede.
Gebruik vervolgens een dunne laag cyanoacrylaatkleefstof om de gesneden hersenen aan de aluminium monsterpost te bevestigen. Schuif vervolgens de liquid cell over de tweede O-ring op de monsterpost en vul de liquid cell met vijf milliliter koolstofdioxide-onafhankelijk medium om het weefsel volledig onder te dompelen. Beweeg het bad in de negatieve X-richting totdat de punt op de hefboom goed boven het bad is geplaatst.
Beweeg vervolgens in de positieve Z-richting totdat de punt volledig ondergedompeld is in het bad en zich voor het monster bevindt. Gebruik het Sample Stage Control-venster om voorzichtig contact te maken en trek vervolgens de trap ongeveer 30 micrometer van het monsteroppervlak weg. Klik onder het Experimentmenu op Impact en stel een impactexperiment in.
Kies een specifieke stootlading die direct verband houdt met de resulterende slagsnelheid op basis van de zwaaiafstandkalibratie. En voer vervolgens het geplande experiment uit. Wanneer de slinger terugzwaait en het monsteroppervlak zich blijft verplaatsen naar het meetvlak, schakel de ond
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert technieken om de visco-elastische mechanische eigenschappen van hersenweefsel op verschillende schalen te karakteriseren. Deze methoden zijn essentieel om te begrijpen hoe de hersenen reageren op verschillende belastingscondities en hoe ziekten de mechanische eigenschappen ervan beïnvloeden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biologische Techniek
- Mechanische Karakterisering
Achtergrond
- Visco-elastische eigenschappen zijn essentieel voor het begrijpen van de mechanica van de hersenen.
- Technieken kunnen de vervorming van de hersenen bij hoge belastingsnelheden beoordelen.
- Ziekten zoals multiple sclerose en autisme kunnen de mechanica van het hersenweefsel veranderen.
- Inzichten kunnen bijdragen aan beschermende strategieën tegen hersenletsels.
Doel van de studie
- Om de visco-elastische eigenschappen van biologische weefsels te meten.
- Om de effecten van verschillende belastingsomstandigheden op de hersenmechanica te onderzoeken.
- Om de bevindingen uit te breiden naar andere biologische weefsels, zoals het hart en de lever.
Gebruikte methoden
- Karakteriseringstechnieken voor biologische weefsels.
- Testen onder een breed scala aan belastingsomstandigheden.
- Beoordeling van materiaaleigenschappen van enkele cellen tot volledige hersenen.
- Modelleren van de hersenrespons tijdens letselscenario's.
Belangrijkste resultaten
- Technieken meten effectief de visco-elasticiteit van hersenweefsel.
- Bevindingen onthullen hoe ziekten de mechanische eigenschappen beïnvloeden.
- Inzichten dragen bij aan het begrip van reacties op hersenletsel.
- Methoden zijn toepasbaar op andere compliant biologische weefsels.
Conclusies
- Karakteriseringstechnieken zijn essentieel voor biologische engineering.
- Inzicht in mechanische eigenschappen helpt bij het voorkomen van letsel.
- De implicaties van het onderzoek reiken verder dan de neurowetenschappen naar andere vakgebieden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Het karakteriseren van de visco-elastische eigenschappen van hersenweefsel over meerdere schalen stelt biopharma R&D in staat om het risico bij targetvalidatie te verkleinen door mechanische fenotypes te koppelen aan ziektegevoelige mechanismen. Deze multiscale benadering vergroot het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen door kwantitatieve, reproduceerbare readouts te leveren die de ontwikkeling van assays en translationele biomarkerstrategieën informeren. De technieken vullen een kritische leemte in het mechanobiologisch onderzoek op door bedrijfsrelevante instrumenten aan te bieden voor screening en lead-identificatie binnen neurotherapeutica.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door te kwantificeren hoe genetische of farmacologische perturbaties de stijfheid en visco-elastische respons van hersenweefsel veranderen.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, lengteschaalspecifieke mechanische meetwaarden die bijdragen aan de verduidelijking van signaalpaden en het biologisch minimaliseren van risico's bij CNS-doelen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door verbindingen te identificeren die pathologische mechanische fenotypes normaliseren in ziekterelevante systemen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, hoge-resolutie mechanische gegevens (kruipcompliantie, krachtrelaxatie, impactrespons) die geschikt zijn voor assay-standaardisatie over micro- tot macroschaalmodellen.
- Operationele waarde: Maakt reproduceerbare meting van mechanische weefseleigenschappen mogelijk onder gecontroleerde hydratatie- en belastingsomstandigheden, wat de robuustheid en schaalbaarheid van de assay ondersteunt.
- Screeningsgereedheid: Faciliteert de voorbereiding van gevalideerde biologische systemen voor downstream-compoundscreening door het vaststellen van baseline mechanische fenotypes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt mechanische veranderingen in hersenweefsel aan ziektebeelden zoals multiple sclerose en autisme, wat de afstemming van translationele biomarkers ondersteunt.
- Operationele waarde: Waarborgt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door het bieden van mechanische fenotypering over verschillende schalen.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Informeert go/no-go-beslissingen door te kwantificeren hoe interventies de mechanische eigenschappen op weefselniveau beïnvloeden die voorspellend zijn voor functionele uitkomsten.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinisch testen, door mechanische fenotypering te bieden op relevante biologische schalen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten en het verduidelijken van signaalpaden door te meten hoe moleculaire veranderingen de visco-elasticiteit van weefsels beïnvloeden op cellulair en weefselniveau.
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve mechanische output (opslag-/verliesmoduli, kruipcompliantie) die een betrouwbare evaluatie van verbindingen over verschillende belastingsnelheden mogelijk maakt.
- Analytics: Genereert frequentie- en tijdsafhankelijke visco-elastische metrieken waarmee teams mechanische fenotypes kunnen vergelijken over verschillende condities en genetische achtergronden.
- Translationeel onderzoek: Verbindt mechanische veranderingen in hersenweefsel met ziektemodellen, wat de preklinische continuïteit en de ontwikkeling van biomarkers ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor mechanische karakterisering dat toepasbaar is op meerdere compliant weefsels (hersenen, hart, lever) over diverse projecten en therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanistische ambiguïteit bij de validatie van CNS-targets te verminderen via directe fenotypering van mechanische eigenschappen op weefselniveau.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid tussen laboratoria via gekalibreerde AFM-, impactindentatie- en rheometrieprotocollen.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door het mogelijk maken van vroege risicoreductie van neurotherapeutische kandidaten op basis van herstel van het mechanische fenotype.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door het identificeren van verbindingen die het normale visco-elastische gedrag herstellen in ziekterelevante hersenweefselmodellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in biomechanica, de bediening van AFM en rheologische analyse om nauwkeurige data-acquisitie en interpretatie te waarborgen.
- Afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder AFM met compliant probes, pendulum-gebaseerde impact indenters en temperatuurgecontroleerde rheometers.
- Necessiteert cross-team standaardisatie van monstervoorbereiding, het behoud van hydratatie en kalibratieprocedures om reproduceerbaarheid te garanderen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het toepassen van technieken op verschillende weefseltypen of ziektestudies met variërende structurele integriteit.
- Beperkt door de aanname van structurele homogeniteit en elastische isotropie, wat mogelijk niet opgaat bij heterogene of pathologisch veranderde weefsels.
