Observatie en kwantificering van telomeren en repetitieve sequenties met behulp van fluorescentie In Situ Hybridisatie (FISH) met PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Het algemene doel van deze fluorescering in situ hybridisatietechniek is om op een beknopte manier het aantal en de lengte van telomeren in C.Elegans te analyseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over tumorregeneratie, alternatieve verlenging van telomeren en cellulaire veroudering. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de procedures beknopt zijn en de telomeren in minder dan 24 uur kunnen worden gevisualiseerd en gekwantificeerd.

Verzamel de gravide volwassen wormen met een beetje vloeibaar medium zonder puin in een buisje van 15 milliliter. Was nu de wormen drie keer zoals hieronder staat. Voeg M9-buffer toe voor een totaal volume van 15 milliliter.

Slinger de buis vervolgens 300 G gedurende drie minuten en gooi de oplossing boven de pellet wormen weg. Herhaal vervolgens het proces. Als de wormen na de centrifugatie blijven drijven, verlicht dan de rem op de centrifuge.

Na de derde wassing, laat de wormen achter met 5 milliliter M9.Voeg vervolgens 6,5 milliliter gedestilleerd water, twee milliliter hyperchloriet en een milliliter vijf molair kaliumhydroxide toe. Laat de wormen drie minuten in deze bleekvloeistof incuberen met 50 RPM agiteren. Vorm de wormen vervolgens om ze open te scheuren en hun eieren te bevrijden.

Zoek onder een dissectiemicroscoop naar de vrijgekomen eieren. Als ze nog niet zijn vrijgekomen, verleng de incubatie of tot acht minuten. Als de wormen grotendeels zijn opgelost en de eieren vrij zijn, vul de buis tot 15 milliliter met M9 en was de eieren drie keer net zoals de wormen eerder werden gewassen.

Voor de gewassen eieren, met het grootste deel van de M9 verwijderd, vul het volume tot 500 microliter met PBST en voeg vervolgens 500 microliter 4% PFA toe. Laad nu 40 microliter aliquoten eieren in 2% PFA in de putjes van polylysine gecoate slides. Breng vervolgens de slides over naar een bevochtigde kamer en laat ze 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen.

Voor dit protocol, heb een aluminium blok op droog ijs dat op 80 graden Celsius is opgeslagen. Zorg ook voor methanol en aceton die op 20 graden Celsius zijn opgeslagen. Nadat de fixatiestap is voltooid, verwijdert u het grootste deel van de PFA-oplossing van de slides, waarbij ongeveer vijf microliters overblijft.

Plaats vervolgens tweede polylysine gecoate slides over elke monsterslide zodat de twee gecoate oppervlakken aan elkaar blijven kleven en de weefsels in het putje worden vastgehouden. Als er teveel fixeermiddel aanwezig is, veeg het dan op met een tissue. Vries nu de slides in door ze minimaal 15 minuten op de koude aluminium blok te plaatsen.

Bereid ondertussen methanol en aceton baden op ijs voor de slides. Zodra de slides bevroren zijn, draai er een om de monster te kraken. Gooi de bovenste slide weg en week de onderste slide vijf minuten in ijskoud methanol.

Doe dit voor alle monsters. Het vriezen van het monster maakt doordringing van sondes en antilichamen mogelijk door de harde eischaal heen. Als de eieren met succes zijn bevroren en gekraakt, zou je de eieren op beide slides kunnen zien.

Na minimaal vijf minuten in methanol, verplaats de slides naar koud aceton gedurende vijf minuten. In nog eens vijf minuten, week de monsters drie keer gedurende vijf minuten per bad in PBST. Na de PBST-wasbeurten kunnen de slides gedurende meerdere dagen in 100% ethanol bij vier graden Celsius worden bewaard.

Om verder te gaan, voeg 20 microliter RNase-oplossing toe aan de monsters en incubeer ze in een bevochtigde kamer bij 37 graden Celsius gedurende een uur. Was vervolgens de slides twee keer gedurende 15 minuten per wasbeurt in 2x SSCT. Na de twee wasbeurten, voeg 20 microliter hybridisatie-oplossing toe aan de monsters en incubeer ze gedurende een uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde kamer.

Bereid ondertussen de sonde voor een dubbelstrengs DNA-sonde voor. Denatureer deze gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius en koel hem vervolgens kort op ijs. Na een uur, aspireer de hybridisatie-oplossing en voeg de sonde-oplossing toe.

Vanaf dit punt bescherm het monster tegen het licht. Na het toevoegen van de sonde, bedek de monsters met glazen deksels. Maak vervolgens een bevochtigde kamer op een hitteblok van 80 graden Celsius.

Wanneer de hitteblok weer is gestabiliseerd tot 80 graden Celsius, plaats de monsters in de verwarmde kamer en laat ze drie minuten denatureren. Incubeer vervolgens alle verwerkte slides gedurende een nacht in een bevochtigde kamer bij 37 graden Celsius. Na de nachtelijke incubatie, was de monsters in PBST bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.

Als voorbereiding, verwarm de hybridisatie-oplossing gedurende een uur voor de wasbeurt tot 37 graden Celsius. Laad vervolgens de slides in een pot hybridisatie-wasoplossing en incubeer ze gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Om de hybridisatie-oplossing te verwijderen, was de monsters met PBST bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.

Doe dit drie keer. Na het aspireren van de laatste PBST-wasbeurt, voeg 20 microliter blokkeringsoplossing toe aan elk monster en incubeer ze in bevochtigde kamers bij kamertemperatuur gedurende een uur in het donker. Aspireer vervolgens de blokkeringsoplossing en vervang deze door FITC-geconjugeerd anti-digoxigenine antilichaam oplossing bij een verhouding van één tot 200.

Dek de slides af en incubeer ze gedurende drie uur in het donker bij kamertemperatuur. Na het antilichaamkleuring, was de monsters twee keer met PBST gedurende 15 minuten per wasbeurt in het donker. Aspireer vervolgens de PBST en vervang deze door 10 microliter montageoplossing die DAPI bevat.

Breng een dekglaas aan en dep eventuele overtollige oplossing op. Verzegelde tenslotte de randen van het dekglaas met nagellak en ga door met het observeren van de monsters onder een fluorescerende microscoop. Met behulp van de PNA-sonde werden de telomeren van dieren waargenomen die een telomere-voldoende mutatie overleefden.