Een methode voor het meten Metabolisme in gesorteerde subpopulaties van Complex Cell Gemeenschappen Met behulp van stabiele isotoop Tracing
4 februari 2017
Dit artikel beschrijft een methode voor het bestuderen van cellulair metabolisme in complexe gemeenschappen van meerdere celtypen, met behulp van een combinatie van stabiel isotooptracering, celsortering om specifieke celtypen te isoleren en massaspectrometrie.
Het algemene doel van deze methode is om isotooptracering te gebruiken om het metabolisme van gesorteerd geordende populaties van complexe celgemeenschappen te meten. Dus met deze methode kunnen we de metabolische verschillen tussen subpopulaties van complexe celgemeenschappen bestuderen, en ook de metabolische samenwerking tussen die subpopulaties. Het grote voordeel van deze techniek is dat door isotooptracering te combineren met celsortering, we een betrouwbaardere meting van het metabolisme kunnen krijgen, en we ook kunnen valideren hoe betrouwbaar de methode is.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat het verschillende technieken combineert, en de manier waarop cellen worden behandeld en de lengte van de procedure kunnen het celmetabolisme beïnvloeden. Voor metabolietenextractie uit een schaal, eerst cellen kweken in een zes-putten plaat in stabiel isotoop gelabeld kweekmedium met gedialyseerde supplementen. Wanneer de cellen 75%confluency bereiken, spoel de putten twee keer met 500 microliters koud HBSS met uniform gelabelde glucose.
Voeg vervolgens 600 microliters van 100%droog ijs gekoelde methanol toe aan elke put, en breng de plaat over naar het droogijs. Gebruik een celschraper om de cellen los te maken en breng vervolgens de extracten van elke put voorzichtig over in individuele microcentrifugebuizen. Bewaar cellen op min 80 graden Celsius tot massaspectrometrie analyse.
Voor metabolietenextractie van gesorteerd geordende cellen, kweken cellen in een 100 millimeter schaal in gelabeld kweekmedium met gedialyseerde supplementen, zodat ze 75%confluency bereiken op de sorteerdag. Voor pulse labeling van celcyclus gesorteerd geordende cellen, kweek de cellen in ongelabeld medium met gedialyseerde supplementen tot ze 75%confluency bereiken. Label vervolgens de cellen gedurende twee uur door het medium te vervangen door vers gelabeld kweekmedium.
Spoel de schaal met warm HBSS met uniform gelabelde glucose, en detacheer de cellen met 1,5 milliliters trypsin EDTA op 37 graden Celsius. Na vier minuten, deactiveer de trypsin met drie milliliters ijs koud HBSS met gelabelde glucose en gedialyseerde supplementen, en breng de cellen over naar een 15 milliliter conische buis voor centrifugatie. Resuspendeer het pellet in HBSS met gelabelde glucose, gedialyseerde supplementen en EDTA bij een concentratie van een tot twee maal 10 tot de zes cellen per milliliter, en filter de cellen door een 40-micron zeef om een enkele cel suspensie te verkrijgen.
Breng de cellen over in een vijf milliliter buis en sorteer ze op een flowcytometer. Voor metabolietenextractie uit mock gesorteerd geordende cellen, verwijder het puin en sorteer alleen de singletten. Voor metabolietenextractie uit celcyclus gesorteerd geordende cellen, verwijder het puin en doubletten, en sorteer cellen in G1 en SG2M, gebaseerd op de geminin sonde fluorescentie.
Aan het einde van de sorteer, verzamel de cellen door centrifugatie en resuspendeer het pellet in 50 microliters ijs koud gedestilleerd water om een homogeen pellet te verkrijgen. Extraheer vervolgens snel de metabolieten door 540 microliters droogijs gekoelde methanol toe te voegen. Bewaar het monster op min 80 graden Celsius tot LCMS analyse.
De extractie van metabolieten uit gesorteerd geordende cellen moet goed van tevoren worden gepland, met experimenteel werk dat zo snel mogelijk wordt voltooid om metabolische veranderingen te minimaliseren. Voor analyse van de geëxtraheerde metabolieten, selecteer eerst een aantal metabolieten met overeenkomstige beschikbare standaarden die goede kwaliteit monsters pieken vertonen. Vervolgens, verifieer de kwaliteit van de pieken, zorg ervoor dat geen valse isotopen worden opgenomen.
Bereken de massaisotoop uit onze fracties voor de isotoop gelabelde monsters door de piekoppervlakte van elke massaisotoop uit onze fractie te delen door de totale piekoppervlakte van alle massaisotopen uit onze fracties. Bereken vervolgens de gelabelde koolstoffracties voor de verrijking van koolstof-13 met behulp van de formule voor koolstofverrijking. Bereken tenslotte de gelabelde stikstoffracties voor de verrijking van stikstof-15 met behulp van de formule voor stikstofverrijking.
In dit representatieve experiment waren 66 metabolieten geselecteerd uit de dataanalyse aanwezig in de mock gesorteerd geordende cellen, waarvan 60 met een vergelijkbare massaisotoop gelabeld leken te zijn uit onze verdelingen tussen de schaalextracten en de mock gesorteerd geordende cellen. Bijvoorbeeld, de massaisotoop uit onze verdeling van glutamaat is vergelijkbaar tussen de schaal en mock gesorteerd extracten, wat aangeeft dat de glutamaat massaisotoop uit onze verdeling ook betrouwbaar is in gesorteerd geordende celpopulaties. Analyse van HELA cellen gesorteerd in G0, G1 of SG2M celcyclusfasen met behulp van de FUCCI geminin sonde onthult cytidine labelen in beide populaties met een hogere verrijking in de SG2M fase, consistent met een verhoogde de novo synthese van nucleotiden tijdens de S fase.
In dit experiment vertoonde de massaisotoop uit onze verdeling hetzelfde patroon in beide celcyclus gesorteerd geordende fracties, wat suggereert dat dezelfde syntheseroute wordt gebruikt, maar actiever is in de SG2M fase, wat aantoont dat metabolische verschillen gemakkelijk detecteerbaar zijn door deze methode, zelfs tussen nauw verwante subpopulaties. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u metabolieten uit gesorteerd geordende fracties kunt extraheren, en de waarschuwingen begrijpen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de cellen snel moeten worden behandeld tijdens het sorteren en metabolietenextractie, aangezien de manier en de duur waarop cellen worden behandeld hun metabolisme kunnen beïnvloeden.
Eenmaal beheerst, kan deze techniek in vijf uur worden uitgevoerd. Deze procedure kan worden toegepast op andere celtypen. Bijvoorbeeld, immuuncel subsets in bloed, of verschillende soorten cellen binnen een tumor, met behulp van een verscheidenheid aan sondes, antilichamen of kleuringsmethoden voor sortering.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het bestuderen van het cellulaire metabolisme in complexe gemeenschappen van meerdere celtypen. De techniek combineert stabiele isotopenmeting, cel sortering en massaspectrometrie om metabole verschillen en samenwerkingen tussen subpopulaties te analyseren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Cellulair metabolisme
- Isotooptracing
- Massaspectrometrie
Achtergrond
- Het begrijpen van het metabolisme in complexe celgemeenschappen is cruciaal voor diverse biologische studies.
- Isotooptracing maakt een gedetailleerde analyse van metabole routes mogelijk.
- Cel sortering helpt bij het isoleren van specifieke celtypen voor nauwkeurigere metingen.
- Massaspectrometrie biedt een gevoelige detectie van metabolieten.
Doel van de studie
- Om het metabolisme van gesorteerde populaties binnen complexe celgemeenschappen te meten.
- Om metabole verschillen tussen subpopulaties te onderzoeken.
- Om metabole samenwerkingen tussen verschillende celtypen te verkennen.
Gebruikte methoden
- Kweek cellen in medium met stabiele isotopenlabels.
- Sorteer specifieke celtypen met behulp van cel-sorteertechnieken.
- Gebruik massaspectrometrie voor de analyse van metabolieten.
- Valideer de betrouwbaarheid van de methode via visuele demonstraties.
Belangrijkste resultaten
- Verbeterd inzicht in metabole verschillen in cel-subpopulaties.
- Aangetoonde metabole samenwerking tussen verschillende celtypen.
- Validatie van de betrouwbaarheid van de gecombineerde methode.
- Voorzien van een visueel kader voor de procedure en de impact ervan op het celmetabolisme.
Conclusies
- De methode biedt een robuuste benadering voor het bestuderen van het cellulaire metabolisme.
- De combinatie van isotoopmeting met cel sortering levert betrouwbare metabole gegevens op.
- Deze techniek kan worden toegepast op diverse onderzoeksgebieden waarbij complexe celinteracties betrokken zijn.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Deze methode pakt een cruciale uitdaging in de discovery biology aan: het verkrijgen van betrouwbare metabole metingen van heterogene celpopulaties zonder het introduceren van artefacten door sortering. Door gebruik te maken van stabiele isotopen tracing en massa-isotopomeerdistributies (MIDs), maakt het de risicoreductie van targetvalidatie mogelijk via een zekerere beoordeling van de substraat- of subpopulatiespecifieke pathway-activiteit. De aanpak ondersteunt het voorspellend vertrouwen in vroege discovery door werkelijke metabole verschillen te onderscheiden van procedurele ruis, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen bij de triage van portfolio's.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door metabole verschillen tussen subpopulaties bloot te leggen, zoals een verhoogde nucleotidesynthese in SG2M-fasen vergeleken met G1-fasen.
- Operationele waarde: Biedt een validatiestap met behulp van mock-gesorteerde controles om te bevestigen dat MIDs ongewijzigd blijven door sorteerstress, wat de gegevensintegriteit waarborgt voorafgaand aan downstream-analyse.
- Predictieve waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door de consistentie van pathways te bevestigen (bijv. nucleotidesynthese), terwijl verschillen in activiteit tussen nauw verwante toestanden worden gekwantificeerd.
Screening & assayontwikkeling
- Klaar voor analyse: Genereert kwantitatieve, reproduceerbare MID-uitlezingen uit gesorteerde fracties die geschikt zijn voor massaspectrometrie met een hoge resolutie en schaalbaar zijn over verschillende steekproefsets.
- Klaar voor screening: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op de evaluatie van verbindingen door basismetabole profielen vast te stellen in gedefinieerde subpopulaties.
- Herbruikbaarheid van het platform: De workflow — een combinatie van isotopenlabeling, sortering en LC-HRMS — kan worden aangepast aan immuunsubsets of tumormicro-omgevingen door gebruik te maken van alternatieve probes of kleuringsmethoden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt metabolische profilering in de ontdekkingsfase met preklinische validatie door consistente meting van pathway-activiteit in gesorteerde populaties over verschillende experimentele modellen mogelijk te maken.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Faciliteert de prioritering van targets of mechanismen op basis van subpopulatie-specifieke metabolische afhankelijkheden, waardoor het aantal foutieve leads in latere stadia wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking, van hypothesetoetsing tot lead-identificatie, en biedt een metabole resolutie die complementair is aan genomische en proteomische analyses van subpopulaties.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van pathways en biologische risicoreductie door metabolische signalen te isoleren die specifiek zijn voor gesorteerde subpopulaties, zoals celcyclusfasen.
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve gegevens over metabolietenverrijking die een betrouwbare vergelijking van compound-effecten over gedefinieerde fracties mogelijk maken.
- Analytics: Genereert massa-isotopomeerdistributies en gelabelde koolstof/stikstoffracties die dienen als stabiele, tijd-geïntegreerde read-outs voor de beoordeling van pathway flux.
- Translationeel onderzoek: Maakt continuïteit mogelijk van de analyse van gesorteerde populaties in vitro naar preklinische modellen door de getrouwheid van de metabolische staat te behouden via MID-gebaseerde validatie.
- Bedrijfbrede herutilisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor metabolisch fenotyperen van elke sorteerbare subpopulatie, waardoor redundante methodeontwikkeling over projecten heen wordt verminderd.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in heterogene systemen te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie via interne controles (mock-gesorteerde monsters) die de methodologische robuustheid verifiëren.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door eerdere en nauwkeuriger go/no-go-beslissingen mogelijk te maken op basis van metabole afhankelijkheden die specifiek zijn voor subpopulaties.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door metabole kwetsbaarheden in verschillende celtoestanden te benadrukken, wat informatie verschaft voor combinatietherapieën of biomarkerstrategieën.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in stabiele isotopenmarkering, flowcytometrie-sortering en LC-HRMS-data-analyse voor berekeningen van metabolietverrijking.
- Is afhankelijk van toegang tot cel-sorters, massaspectrometrie-platforms en isotoopgemarkerde media met gedialyseerde supplementen.
- Vereist gestandaardiseerde verwerkingsprocedures om metabole drift tijdens sortering en extractie te minimaliseren, in het bijzonder voor tijdgevoelige monsters.
- Omvat aanpassingen bij de toepassing van de methode op primaire cellen of weefsels met variërende fragiliteit of sorteringsefficiëntie.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de noodzaak voor snelle metabolietextractie na sortering om ex vivo metabole veranderingen te voorkomen, zoals vermeld in het protocol.
