Viervoudige Immunostaining van de Olfactorische Lamp voor Visualisatie van Olfactorische Sensorische Axon Moleculaire Identiteitscodes
5 juni 2017
Olfactorische zintuiglijke neuronen vormen een grote verscheidenheid aan axon-sorterende moleculen om een goede neurale schakeling te vormen. Dit protocol beschrijft een immunohistochemische kleuring methode om combinatorische expressies van axon-sorterende moleculen te visualiseren bij de axon termini van olfactorische sensorische neuronen.
Het algemene doel van deze immuno-histochemische kleuringsmethode is om de gecombineerde expressie van axon-sorteringsmoleculen te visualiseren aan de axon-einden van olfactorische sensorische neuronen. Deze methode kan helpen bij het karakteriseren van belangrijke processen op het gebied van olfactorische ontwikkeling, zoals axon-geleiding, synapsformaties en de regeneratie van olfactorische sensorische neuronen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het wetenschappers toestaat om de expressiepatronen van axon-sorteringsmoleculen in de reukbol te vergelijken en analyseren zonder variatie tussen secties te ondervinden.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de inbeddingsstap moeilijk te leren is, omdat de positie en hoek van het olfactorische weefselmonster in de mal moeilijk in woorden te beschrijven zijn. Begin met hoofden van muizen van één tot twee weken oud die gefixeerd zijn door intracardiale perfusie van 4% paraformaldehyde. Plaats een schaarblad in de ruimte tussen de boven- en ondertanden en snijd horizontaal om het onderkaakbeen te verwijderen.
Verwijder vervolgens overtollig weefsel met pincetten en schaar, om het olfactorische weefsel te laten, inclusief de reukbol en het olfactorische epitheel. Dompel het olfactorische weefsel in PBS om lucht in de neusholte te verwijderen, maak vervolgens een verticale snede om het achterste deel van de hersenen te verwijderen en plaats het olfactorische weefsel met de gesneden uiteindkant naar beneden op de bodem van een inbeddingsmal. Vul de mal met compound voor optimale snijtemperatuur en dompel vervolgens in vloeibare stikstof.
Nadat het weefsel en OCT volledig bevroren zijn, breng het weefsel gedurende een uur in evenwicht in de cryostaat bij 20 graden Celsius. Maak nu seriële parasaggitale secties van de reukbol met de cryostaat en verzamel ze door ze op MAS gecoate glasplaten te plakken. Droog de platen onmiddellijk na het plakken met een föhn.
Begin met immunokleuring door de gedroogde platen vijf minuten bij kamertemperatuur te wassen met PBS. Blokkeer niet-specifieke bindingsplaatsen door de platen een uur te incuberen met 5% blokkeeroplossing bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 400 microliter van een cocktail van primaire antilichamen verdund in 1% blokkeeroplossing toe aan elke plaat.
Incubeer de platen een nacht bij kamertemperatuur. Gooi de volgende dag de primaire antilichaamoplossing weg en was de platen met PBST drie keer gedurende vijf minuten elk bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 400 microliter van een cocktail van secundaire antilichamen en PBS toe aan elke plaat.
Bescherm tegen licht en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Gooi na de incubatie de oplossing weg en was de platen opnieuw drie keer gedurende vijf minuten elk met PBS bij kamertemperatuur. Monteer ten slotte dekglasjes op de platen door twee druppels montagemedium op elke plaat aan te brengen, het dekglasje te plaatsen en luchtbellen te verwijderen.
Verkrijg fluorescente beelden met de fluorescentiemicroscoop met behulp van de juiste filter voor elke fluorofoor. Pas de belichtingstijd aan om fluorescente signalen van het beeld te verkrijgen zonder verzadiging. Definieer de glomerulaire structuur door immunofluorescente signalen van GLUT2.
Gebruik Image J om de kleuringsintensiteiten van axon-sorteringsmoleculen binnen glomeruli te meten. Dit beeld toont een parasaggitale reukbolsectie van een twee weken oude muis geïmmunokleurigd met antilichamen tegen VGLUT2, Kirrel2 getoond in rood, Semaforine 7A getoond in groen en OLPC in blauw. Het samengevoegde beeld toont dat de axon-sorteringsmoleculen die betrokken zijn bij glomerulaire segregatie in een positie-onafhankelijk mozaïekpatroon worden uitgedrukt.
Elke glomerulus wordt gedefinieerd door fluorescente signalen van de presynaptische marker VGLUT2. De glomerulaire structuren zijn omgeven door stippellijnen. Signaalintensiteiten van axon-sorteringsmoleculen werden in elke glomerulus gemeten.
Zoals hier te zien is, worden axon-sorteringsmoleculen differentieel uitgedrukt in elke glomerulus. Glomerulus 3 heeft bijvoorbeeld hoge niveaus van OLPC, intermediaire niveaus van Semaforine 7A en lagere niveaus van Kirrel2, en dit verschil kan worden gekwantificeerd door de kleuringsintensiteit te meten. Terwijl glomerulus 4 hoge niveaus van OLPC heeft en lagere niveaus van Kirrel2 en Semaforine 7A.
Nogmaals, dit verschil kan worden gekwantificeerd door de kleuringsintensiteit te meten. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om post-fixatie met PFA en behandeling met sucrose-oplossing weg te laten, die normaal gesproken worden aanbevolen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u meer glomeruli op de enkele reukbolsectie kunt plaatsen en hoe u hoogwaardige immunokleuring met meerdere antilichamen kunt uitvoeren, die op andere hersengebieden kunnen worden toegepast.
Vergeet niet te hopen dat deze methode u zal helpen succes te hebben in uw toekomstige experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een immunohistochemische kleuringsmethode om de expressie van axon-sorteermoleculen te visualiseren bij de axonterminalen van olfactorische sensorische neuronen. Deze techniek is essentieel voor het begrijpen van olfactorische ontwikkelingsprocessen, zoals axongeleiding en synapsevorming.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Olfactorische ontwikkeling
- Immunohistochemie
Achtergrond
- Olfactorische sensorische neuronen spelen een sleutelrol bij het reukvermogen.
- Axon-sorteringsmoleculen zijn essentieel voor het tot stand brengen van de juiste neurale schakelingen.
- Het begrijpen van hun expressiepatronen kan inzicht bieden in de functies van het olfactorische systeem.
- Het visualiseren van deze expressies kan helpen bij het bestuderen van regeneratieprocessen in olfactorische sensorische neuronen.
Doel van de studie
- Om de gecombineerde expressie van axon-sorteringsmoleculen te visualiseren.
- Om sleutelprocessen in de olfactorische ontwikkeling te karakteriseren.
- Om de vergelijking van expressiepatronen in de bulbus olfactorius te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Immunohistochemische kleuringstechniek.
- Gebruik van muizenkoppen op een leeftijd van één tot twee weken.
- Intracardiale perfusie met 4% paraformaldehyde voor fixatie.
- Inbedding en coupesnijden van reukweefselmonsters.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van de expressie van axon-sorteringsmoleculen.
- Aangetoonde capaciteit om expressiepatronen te analyseren zonder variatie tussen coupes.
- Voorzien in een duidelijke methode voor het inbedden van reukweefsels.
- Benadrukt het belang van visuele demonstraties voor het aanleren van de techniek.
Conclusies
- De immunohistochemische methode is effectief voor het bestuderen van olfactorische sensorische neuronen.
- Inzicht in axon-sorteringsmoleculen kan de kennis over de ontwikkeling van het olfactorische systeem vergroten.
- Deze techniek kan een waardevol instrument zijn voor toekomstig onderzoek naar olfactorische regeneratie.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Deze methode maakt nauwkeurige moleculaire mapping van axon-sorteermoleculen in de bulbus olfactorius mogelijk, wat doelwitvalidatie in neuro-ontwikkelingsonderzoek ondersteunt. Door een kwantitatieve vergelijking van eiwitexpressiepatronen over glomeruli mogelijk te maken zonder variabiliteit tussen de coupes, vergroot het de voorspellende betrouwbaarheid in mechanistische studies naar de vorming van neurale circuits. De aanpak biedt een schaalbaar, reproduceerbaar platform voor het verminderen van risico's bij hypothesen met betrekking tot axongeleiding en synaptische specificiteit in preklinische discovery-pipelines.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om moleculaire identiteitscodes bij axonale termini te onderzoeken om de mechanismen van target-engagement bij de ontwikkeling van olfactorische sensorische neuronen te verduidelijken.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele target-validatie door de expressie van axon-sorteermoleculen te correleren met glomerulaire organisatiepatronen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door het vaststellen van gestandaardiseerde immunostaining-protocollen voor multiplex proteïnedetectie.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan door een consistente definitie van glomeruli met behulp van VGLUT2 als presynaptische marker.
- Strategische waarde: Benadrukt de gereedheid voor screening via kwantitatieve intensiteitsmetingen die een betrouwbare vergelijking van moleculaire expressie over verschillende experimentele condities mogelijk maken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziektebeelden door axon-sorteringsmolecuulcodes te koppelen aan processen van neurale circuitvorming die toepasbaar zijn op neurodegeneratieve modellen.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door longitudinale analyse van axonale regeneratie en re-innervatiepatronen mogelijk te maken.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van hypothesen over targets tot de identificatie van lead-verbindingen, door moleculaire resolutie te bieden van axonale geleidingsmechanismen die cruciaal zijn voor de ontwikkeling van neurotherapeutica.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing van OR-specifieke axonale geleiding ondersteunt via visualisatie van de combinatorische moleculaire code bij de axonterminals.
- Screening: Beschrijft de gereedheid voor assays door gestandaardiseerde sectiecollectie en immunokleuring die technische variatie tussen monsters minimaliseert.
- Analytics: Benadrukt kwantitatieve read-outs vanuit ImageJ-gebaseerde intensiteitsmetingen die statistische vergelijking van de expressie van axon-sorteringsmoleculen over glomeruli mogelijk maken.
- Translational Research: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door analyse mogelijk te maken van olfactorische regeneratieprocessen die relevant zijn voor letselmodellen.
- Enterprise Reuse: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit voor multiplex proteïneprofilering in andere hersengebieden buiten het olfactorische systeem.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij targetvalidatie door directe visualisatie van moleculaire determinanten van axonale segregatie.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid gerealiseerd via consistente protocollen voor weefselinbedding en coupesnijden.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen door het verminderen van mechanistische ambiguïteit in neurale padmodellen.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering door kwantitatieve, biomarker-achtige read-outs van co-expressiepatronen van axon-sorteringsmoleculen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in immunohistochemie, cryosectie en fluorescentiemicroscopie.
- Behoeften op het gebied van instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder een cryostaat, fluorescentiemicroscoop en software voor beeldanalyse.
- Vereisten voor standaardisatie tussen teams voor antilichaamvalidatie en consistentie van het kleuringsprotocol.
- Overwegingen voor aanpassing tussen modelsystemen, met name voor weefsels met verschillende inbeddingseigenschappen.
- Praktische beperkingen omvatten de technische uitdaging van de weefseloriëntatie in inbeddingsvormen, waarvoor praktische training nodig is om deze te beheersen.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
5:42
Conclusion
4:26
Results: Quantification of Axon-sorting Molecules in the Olfactory Bulb
1:11
Preparation of Parasagittal Olfactory Bulb Sections
2:33
Day 1: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:07
Day 2: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:56
The Use of Fluorescence Intensity Measurements
