Lineage Tracing en klonnale analyse in het ontwikkelen van cerebrale cortex met behulp van Mozaïek Analyse met dubbele markers (MADM)
8 mei 2020
Een protocol voor het uitvoeren van lijntracering en functionele genetische analyse van kandidaat-genen op een celniveau met behulp van mozaïekanalyse met dubbele markers (MADM) wordt gepresenteerd. MADM kloonanalyse biedt een kwantitatief kader om het proliferative gedrag, cellulaire output en afstammingsrelatie van individuele voorlopers en hun dochtercellen te meten.
Mosaic Analysis met Double Markers technologie is een krachtige methode die zeer kwantitatieve informatie kan bieden over het proliferatiegedrag en kelderoutput van individuen stamcellen. Een uniek kenmerk van deze techniek, is dat het mogelijk maakt afstamming tracing en functionele genetische analyse van kandidaat-genen op het niveau van de single cell.demontrating aan de procedure zal zijn, Carmen Streicher, uw technicus, Nicole Amberge, post-doc, Gisselle Cheung, post-doc en Andy Hansen, een promovendus uit mijn laboratorium. Om MADM recombinatie gebeurtenissen in experimentele muizen te induceren, gebruik dan een 1ml spuit uitgerust met een 25-meter naald om een enkele injectie van Tamoxifen Intraperitoneal te leveren in een getimede tot zwangere moeder. Van MADM klonale analyse tot postnatale tijdstippen. Plaats op embryonale dagen 18 tot 19 een zwangere muis in de supinepositie en desinfecteer de vacht met 70%ethanol. Maak een kleine incisie in de huid in de onderbuik boven de baarmoeder en maak een tweede incisie door de spieren en de buikspierwand om het buikvlies te onthullen. Gebruik een schaar om de baarmoeder te scheiden van de omliggende weefsels en plaats de intacte baarmoeder in een handschoen met warm water. Gebruik vervolgens fijne tipschaar en vingers om de baarmoederwanden zorgvuldig te openen om de embryo's vrij te geven. Reinig de pups zachtjes drukken op de borst van tijd tot tijd om de ademhaling te starten voordat de overdracht van de prenatale dieren aan een pleegmoeder. Om neurale MADM Clone Tissue te verzamelen plaats een verdoofd dier in de supine positie op een perfusie operatie lade en desinfecteren de vacht met 70%ethanol. Gebruik schaar en tang om een incisie te maken door de huid en een incisie door de spierlaag. Wanneer de borstholte zichtbaar is, snuiven en til het middenrif om het hart te onthullen en zorgvuldig trim en pin de ribbenkast aan de chirurgische lade.insert een naald aangesloten op een peristaltische pomp buizen gevuld met PBS in de linker linker hartkamer en gebruik kleine Iris schaar om een incisie te maken in het achterste uiteinde van het rechter atrium. Doorsnede het cardiovasculaire systeem met de PBS onmiddellijk gevolgd door perfusie met vers bereide ijskoude 4%paraformaldehyde in PBS. Wanneer de perfusie is voltooid, verwijder de hersenen door zorgvuldige dissectie en plaats het geoogste orgaan in ten minste vijf keer het hersenvolume van verse 4% paraformaldehyde 's nachts op 4
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor lineage tracing en functionele genetische analyse van kandidaatgenen op single-cell niveau met behulp van Mosaic Analysis with Double Markers (MADM). De MADM-klonale analyse maakt een kwantitatieve meting mogelijk van het proliferatieve gedrag en de cellulaire output van individuele progenitorcellen en hun nakomelingen.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Lineage tracing
- Genetische analyse
- Stamcelbiologie
Achtergrond
- MADM-technologie is essentieel voor het begrijpen van celproliferatie.
- De methode maakt tracking op single-cell niveau mogelijk.
- Toepassingen omvatten het beoordelen van cellulaire output en lineage-relaties.
Gebruikte methoden
- Mozaïekanalyse met dubbele markers (MADM)
- Experimenteel model: Muizen
- Technieken omvatten intraperitoneale injecties en weefselperfusie.
Belangrijkste resultaten
- Maakte gedetailleerd onderzoek naar het gedrag van progenitorcellen mogelijk.
- Bood inzicht in de afstammingsrelaties van dochtercellen.
- Demonstreerde een betrouwbare methode voor functionele genetische analyse.
Conclusies
- Deze studie biedt een uitgebreid protocol voor het gebruik van MADM bij genetische analyse.
- De resultaten leveren een significante bijdrage aan het veld van de ontwikkelingsbiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie
Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) maakt lineage tracing en clonale analyse met een ongekende resolutie op single-cell niveau mogelijk in de ontwikkelende cerebrale cortex, waarmee de uitdaging van het in kaart brengen van het lot en de delingspatronen van neurale stamcellen direct wordt aangepakt. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellende vertrouwen bij de validatie van vroege neuro-ontwikkelingsdoelen en ondersteunt mechanistische risicoreductie voor beslissingen omtrent het CNS-portfolio. De kwantitatieve en kwalitatieve resultaten van MADM positioneren deze methode als een cruciaal instrument voor functionele genetische analyse in R&D-pijplijnen gericht op neurobiologie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt nauwkeurige analyse van overgangen in de lijn van neurale stamcellen en divisiemodi mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van kandidaatgenen in neurodevelopmentale pathways.
- Biedt mechanistische risicoreductie door controle- en mutant-subklonen in vivo te onderscheiden.
- Faciliteert targetselectie met een hoge betrouwbaarheid voor therapeutische programma's voor het centrale zenuwstelsel.
Screening & assayontwikkeling
- Genereert gevalideerde single-cell lineage-kaarten voor downstream fenotypische screening.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve readouts van proliferatie van progenitorcellen en fate-specificatie.
- Ondersteunt assay-standaardisatie door comparatieve analyse binnen dezelfde weefselomgeving mogelijk te maken.
- Bereidt robuuste biologische systemen voor op de evaluatie van verbindingen in neurodevelopmentale contexten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt resultaten van lineage tracing uit met de vorming van ziekterelevante neurale circuits.
- Maakt continuïteit mogelijk van genetische manipulatie in de ontdekkingsfase tot validatie in preklinische modellen.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang van CNS-targets op basis van in vivo functioneel bewijs.
- Biedt translationele biomarker-inzichten via clonale analyse van neurale progenitorcellen.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Lijnstambepaling op basis van MADM integreert van vroege ontdekking tot lead-identificatie en preklinische validatie in pipelines die gericht zijn op het CZS.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesetoetsing met hoge resolutie mogelijk voor het lot en de delingspatronen van neurale stamcellen.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare lineage-gegevens voor assay-ontwikkeling en compound-screening.
- Analyses: Biedt optische en statistische output voor het vergelijken van het gedrag van controle- en mutante progenitorcellen.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen ontdekkingsbevindingen en preklinische modellen door lineage-uitkomsten in vivo in kaart te brengen.
- Enterprise-hergebruik: Aanpasbaar aan elke murine stamcelniche met geschikte CreERT2-drivers, wat de schaalbaarheid van het platform ondersteunt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar neurale lineage.
- Operationele waarde: Standardiseert workflows voor lineage tracing en clonale analyse voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en vermindert biologische risico's in een laat stadium binnen CNS-portefeuilles.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van neuro-ontwikkelingstargets mogelijk op basis van in vivo functionele data.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in genetische manipulatie, in vivo lineage tracing en neuroanatomische dissectie.
- Vereist toegang tot muismodellen met CreERT2-drivers en geavanceerde imaging-infrastructuur.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor reproduceerbare clonale analyse en datainterpretatie.
- Aanpasbaar aan verschillende stamcelniches met geschikte genetische drivers en weefselverwerkingsprotocollen.
- Beperkt tot muissystemen waar genetische tools en weefseltoegang haalbaar zijn.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Tamoxifen (TM) Induction in Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) Mice
2:00
MADM Clone Brain Tissue Harvest
3:12
MADM Brain Tissue Sectioning
4:30
Adult Tissue Mounting
5:29
Confocal Image Acquisition and MADM Clone Quantification
6:29
Serial 3D Clone Reconstruction
7:30
Results: Representative Lineage Tracing and Clonal Analysis
8:41
Conclusion
