Op fotodiode gebaseerde optische beeldvorming voor het opnemen van netwerkdynamica met single-neuronresolutie in niet-transgene ongewervelde dieren

Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van hoe een fotodiodenarray en spanningsgevoelige kleurstoffen kunnen worden gebruikt om actiepotentialen van grote aantallen neuronen gelijktijdig op te nemen. In vergelijking met calciumbeeldvorming van neurale activiteit, die indirect is, registreren de spanningsgevoelige kleurstoffen die we gebruiken actiepotentialen direct, vergelijkbaar met scherpe elektrode-opnames, maar over vele neuronen tegelijk. Onze optische beeldvormingsworkflow kan worden aangepast om netwerkactiviteit snel te visualiseren met single neuron- en single actiepotentiaalresolutie in een verscheidenheid aan niet-transgene ongewervelde en zelfs gewervelde systemen.

Bovendien zal Evan Hill uit mijn laboratorium de procedures in ons protocol demonstreren. Begin met het verdoven van een 40 gram Aplysia californica dier en prik het met de buikzijde omhoog in een gewaxte dissectieschaal. Gebruik dissectiescharen om een twee tot drie centimeter lange middenincisie te maken langs de meest voorste uiteinden van de voet en prik de flappen van de voet aan beide zijden van de incisie vast om een deel van het centrale zenuwstelsel en de buccale massa te onthullen.

Gebruik pincetten en dissectiescharen om voorzichtig het buccale mass te dissecteren, waardoor de hersenganglia zichtbaar worden, en snij de zenuwen door die het lichaam van het dier innerveren om het centrale zenuwstelsel te verwijderen, waarbij een lange lengte van de zenuw overblijft om te stimuleren. Gebruik minutian-pins om het centrale zenuwstelsel in een met zoutoplossing gevulde elastomeer-gevulde schaal te positioneren en perfundeer de schaal met zoutoplossing die door een Peltier-koelapparaat is gepasseerd om de bereidingstemperatuur op 15 tot 16 graden Celsius te houden. Gebruik de pincetten en microdissectiescharen om overtollig bindweefsel van de zenuwen te verwijderen en een oppervlakkig deel van de schede op het of de ganglia die moeten worden afgebeeld, weg te snijden.

Dompel vervolgens het schoongemaakte centrale zenuwstelsel 20 seconden in een oplossing van 0,5% glutaaraldehyde in zoutoplossing voordat het centrale zenuwstelsel wordt teruggeplaatst in de met zoutoplossing geperfundeerde elastomeer-gevulde schaal om eventuele overtollige glutaaraldehyde weg te spoelen. Om een werkoplossing van spanningsgevoelige kleurstof te bereiden, voegt u 500 microliter zoutoplossing toe aan een eerder bereide vaste aliquot van RH 155 om een uiteindelijke kleurstofconcentratie van 0,3 milligram per milliliter te bereiken. En gebruik een handbediende microdispenser om 200 microliter oplossing in een stuk polyethyleenbuis te laden met een vergelijkbare diameter als die van de ganglia die moeten worden gekleurd.

Gebruik een micromanipulator om voorzichtig het uiteinde van de buis over het doelganglion te plaatsen, waarbij de buis wordt verlaagd tot deze een strakke afdichting over het ganglion vormt. Draai de applicatorknop van de microdispenser elke vijf minuten gedurende een uur om meer kleurstof op het ganglion te forceren, en controleer het monster na 30 minuten om te bevestigen dat voldoende kleuring plaatsvindt. Na het kleuren, met de lichten gedimd, plaatst u een geschikt buffermateriaal links en rechts van waar de voorbereiding in de zoutoplossingsbevattende beeldvormingskamer zal worden geplaatst, en dompelt u vervolgens het centrale zenuwstelsel in de kamer.

Druk een geschikt formaat van een dekglas over het weefsel en druk stevig op het dekglas om het weefsel plat te maken zonder de neuronen te beschadigen. Plaats vervolgens de beeldvormingskamer onder een dissectiescoop. Als u een zenuw stimuleert om een fictief motorisch programma te eliciteren, smelt u voorzichtig een segment van PE100 polyethyleenbuis over een vlam terwijl u zachtjes aan beide uiteinden van het buissegment trekt en snijd het resulterende taps toelopende uiteinde op het gewenste punt.

Bevestig vervolgens een lengte van dikwandige flexibele polymeerbuis aan het achtereind van een polyethyleen zuigelektrode. Gebruik vervolgens een mondelinge sectie om negatieve druk te creëren en een klein volume zoutoplossing door de taps toelopende uiteinden van de zuigelektrode te trekken. Trek het uiteinde van de zenuw die moet worden gestimuleerd in de elektrode onder de microscoop en controleer of de zoutoplossing in de elektrode geen luchtbellen bevat die de elektrische geleiding kunnen onderbreken.

Voor het beeldvormen van het ganglion, verplaatst u de kamer naar de beeldvormingsinstallatie en start u de zoutoplossingsperfusie door de opnamekamer heen. Plaats een temperatuursensor nabij de voorbereiding en stel de temperatuur in zoals passend voor de soort die wordt afgebeeld. Plaats een gechloreerde zilverdraad neer de zuigelektrode in, ervoor zorgen dat deze contact maakt met de zoutoplossing in de elektrode en plaats een zilver-zilverchloridedraad in de badzoutoplossing nabij de zuigelektrode.

Laat de waterimmersielens in de zoutoplossing zakken en sluit de basisdiafragma. Verhoog of verlaag de sub-traps condensor en pas de focus aan tot de randen van het diafragma scherp in beeld staan, waardoor Kohler-verlichting ontstaat. Richt u op het gebied van de voorbereiding dat moet worden afgebeeld en neem een afbeelding van het ganglion van belang op met de parfocale digitale camera.

Stel de bedieningspaneelversterkingsschakelaar op 1X en klik op de knop voor de rustlichtintensiteit om de gemiddelde rustlichtintensiteit van de diodes te controleren. Pas het spanningsniveau aan dat van een stimulator naar de LED-lampvoeding wordt gestuurd en blijf de gemiddelde rustlichtintensiteit controleren totdat deze in het gewenste bereik ligt. Stel vervolgens de bedieningspaneelversterkingsschakelaar in op 100X voor de opname en controleer nogmaals of de veer- of luchttafel drijft.

Met de lichten nog gedimd, stelt u de bestandsduur, het pad en de naam in de beeldvormingssoftware in en klikt u op gegevens opnemen om bestanden op te nemen tot de capaciteit van het beschikbare RAM van de computer. Zorg ervoor dat u stil blijft tijdens het opnemen, omdat kleine trillingen grote artefacten in de optische opnamegegevens kunnen veroorzaken. Om de gegevens onmiddellijk na de opname te bekijken, gebruikt u de super